木薯組培苗中葉綠素和類胡蘿卜素含量分析

羅秀芹　韋卓文　楊龍　薛晶晶

摘要：以TM60444和SC9木薯（Manihot esculenta Crantz）組培苗根、莖、葉為材料，采用乙醇∶丙酮溶液萃取方法，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)兩種木薯組培苗根、莖、葉中的葉綠素和胡蘿卜素含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，兩個(gè)品種葉綠素和胡蘿卜素含量都是葉>莖>根;而類胡蘿卜素含量是葉>莖≈根。

關(guān)鍵詞：木薯（Manihot esculenta Crantz）;類胡蘿卜素;定量PCR;紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)

中圖分類號(hào)：S533? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）04-0136-05

Abstract： Ultraviolet-visible spectrophotometer was used to detect the content of chlorophyⅡ and carotenoids in TM60444 and SC9 tissues culture seedings. Meanwhile， the relative genes of carotenoids biosynthesis were analyzed. The results showed that there is nearly no difference between two stains and the contents of chlorophyll and total carotene in two seedings： leaf>stem>root; and the content of carotenoids： leaf>stem， while the stem is approximately the root.

Key words： cassava Manihot esculenta Crantz; carotenoid; RT-PCR; UV spectrophotometer

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬植物，具有高淀粉、高生物量、耐貧瘠、抗旱等優(yōu)良屬性[1]。木薯、甘薯和馬鈴薯合稱世界三大薯類，廣泛栽培于熱帶及亞熱帶部分地區(qū)，是全世界近10億人的口糧。木薯因其塊根富含淀粉，具有運(yùn)用的廣泛性和獨(dú)特性，除了可以作為部分地區(qū)的主糧外，在化工、醫(yī)療、紡織等方面都有重要作用，也是動(dòng)物飼料的重要來(lái)源，同時(shí)也是世界上公認(rèn)的一種具有發(fā)展?jié)摿Φ目稍偕茉醋魑颷2，3]。木薯葉片粗脂肪、可溶性糖、蛋白質(zhì)等含量高，可用作動(dòng)物飼料[4-6]。光照是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必要條件，是光合作用的能量來(lái)源和主導(dǎo)因子，而光合作用的主要器官是植物葉片。光合作用過(guò)程中吸收光能的植物色素主要有葉綠素（葉綠素a、葉綠素b）和類胡蘿卜素（胡蘿卜素、葉黃素），其中葉綠素a和葉綠素b是吸收光能的主要物質(zhì)，直接影響植物光合作用光能利用[7]。在完整的生物系統(tǒng)中，類胡蘿卜素和葉黃素是共存的;而在光合系統(tǒng)中，葉綠素又與葉黃素共存[8]。目前，研究木薯植株多采用盆栽苗或地栽苗[9-12]，木薯組培苗周期短、易于操作，除了可以檢測(cè)葉片，也可同時(shí)檢測(cè)莖和根部類胡蘿卜素含量，其結(jié)果對(duì)木薯植株研究也有重要的指導(dǎo)意義[13]。此外，組培苗快速繁殖對(duì)木薯葉飼用需求也是一個(gè)很好的解決途徑。

本研究對(duì)兩種木薯主栽品種組培苗根、莖、葉，采用有機(jī)溶劑乙醇∶丙酮（1∶1）溶液萃取，測(cè)定其葉綠素和類胡蘿卜素的含量，并結(jié)合熒光定量PCR分析其含量與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，旨在揭示木薯組培苗間類胡蘿卜素積累的差異。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為TM60444和SC9兩種木薯組培苗，擴(kuò)繁于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室組培室中，26 ℃光照16 h，黑暗8 h培養(yǎng)45 d。剪取每個(gè)品種的根、莖、葉各3份（0.1 g/份），液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ硗夥Q取3份（0.3 g/份），待提取類胡蘿卜素。

1.2? RNA提取與熒光定量PCR

1）提取根、莖、葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA第一鏈。每份樣品取0.1 g保存于EP管中，置于-80 ℃保存，保存樣品的EP管加入小鋼珠后用液氮凍脆上下晃研磨至粉碎，參照天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取總RNA;反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈參照北京全式金生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA第一鏈試劑盒。

2）引物設(shè)計(jì)和熒光定量PCR方法參照文獻(xiàn)[14]。

1.3? 類胡蘿卜素的提取與測(cè)定

參照黃秋蟬等[15]將樣品用液氮研磨粉碎后置于20 mL離心管中，加入15 mL乙醇丙酮萃取液（1∶1，V/V），避光浸泡萃取24 h，期間顛倒混合3次，直至待測(cè)材料完全失去綠色為止，同時(shí)以乙醇丙酮萃取液為空白對(duì)照。利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在470.0、474.0、485.0、462.5、649.0和665.0 nm波長(zhǎng)下測(cè)定胡蘿卜素、葉黃素提取液的吸光度。并按照以下公式算出葉綠素和類胡蘿卜素含量（mg/L）：

葉綠素a含量=9.99A665 nm-0.086 7A642.5 nm

葉綠素b含量=17.7A642.5 nm-3.04A665 nm

總?cè)~綠素含量=27.9A649 nm

胡蘿卜素含量=12.6A485 nm-6.00A470 nm-0.029 8a+0.336b

葉黃素含量=10.2A470 nm-11.5A485 nm-0.003 6a-0.625b

總類胡蘿卜素含量=4.92A474 nm-0.025 5a-0.225b

2? 結(jié)果與分析

2.1? 類胡蘿卜素代謝途徑基因表達(dá)情況

根莖葉中MePSY、MeCRTISO2、MePDS、MeZDS、MeLCYB、MeBCH、MeVDE、MeNXS、MeXAN和MeAAO基因相對(duì)表達(dá)情況如圖1所示。TM60444中除了MeXAN和MeAAO呈下降趨勢(shì)，其他基因表達(dá)水平基本呈上升趨勢(shì)。SC9中類胡蘿卜素代謝途徑中所有基因基本呈下降或不變的趨勢(shì)，MeNXS基因在兩個(gè)品種的根莖葉中都不表達(dá)。TM60444中除了MeAAO，其他9個(gè)基因表達(dá)情況下類胡蘿卜素含量基本是一致的，在根莖葉中含量隨著基因表達(dá)呈上升趨勢(shì);而SC9根莖葉中所有基因表達(dá)基本變化不大甚至出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，兩個(gè)品種間的差異較明顯。

2.2? 類胡蘿卜素含量

TM60444和SC9根莖葉根類胡蘿卜素含量如圖2至圖4所示。類胡蘿卜素含量是葉片中含量最高，根部和莖部接近。TM60444根部和葉片的胡蘿卜素含量均比SC9高，特別是葉片;SC9莖中胡蘿卜素含量卻高于TM60444。葉黃素和總類胡蘿卜素的含量都是葉中含量最高，莖中次之，根中最少。而SC9葉片葉黃素含量明顯比TM60444高兩倍多，兩個(gè)品種根中葉黃素含量都出現(xiàn)了負(fù)值。類胡蘿卜素包括葉黃素和各種胡蘿卜素等，兩個(gè)品種根莖葉中類胡蘿卜素含量都很相近。

2.3? 葉綠素含量

TM60444和SC9根、莖、葉中葉綠素含量如圖5、圖6所示。葉綠素a和葉綠素b含量都是葉片中含量最高，莖部次之，根部最少。葉綠素含量趨勢(shì)與類胡蘿卜素含量基本一致。

3? 討論

高等植物體內(nèi)的色素主要以葉綠素、類黃酮和類胡蘿卜素等形式存在，其中葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b;類黃酮主要是花色苷;類胡蘿卜素主要包括各種胡蘿卜素和葉黃素[16]。木薯葉片中含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，而氨基酸中纈氨酸（Val）和異亮氨酸（Ile）是合成亞麻苦苷和百脈根苷的主要原料[17]。木薯組培苗葉片中也含多種有效成分，葉綠素和類胡蘿卜素含量最高。莖和根中也有少量的葉綠素和類胡蘿卜素，這是由于組培苗生長(zhǎng)在透光的組培瓶中，莖和根同時(shí)也能捕獲到光源進(jìn)行光合作用，合成相應(yīng)的色素。類胡蘿卜素屬于二萜類化合物，主要由質(zhì)體合成途徑，番茄紅素是第一個(gè)合成的類胡蘿卜素前體，分支為α胡蘿卜素和β胡蘿卜素，而α胡蘿卜素又是葉黃素的前體。葉黃素主要存在于綠色植物的葉綠素中，屬于類胡蘿卜素，通常顏色越是深綠的植物，葉黃素的含量就越高。本研究顯示葉黃素含量基本與葉綠素含量是一致的。兩個(gè)品種根中葉黃素出現(xiàn)負(fù)值，可能是因?yàn)槿~黃素本身的抗氧化作用，對(duì)藍(lán)光有吸收，也可能是葉黃素本身的不穩(wěn)定產(chǎn)生降解或異構(gòu)化[18，19]，而根中本身含量就比較低，造成該波長(zhǎng)下檢測(cè)出負(fù)數(shù)。總的來(lái)說(shuō)，組培苗葉片中的葉綠素、葉黃素和總類胡蘿卜素含量都是最高的。前期對(duì)塊根類胡蘿卜素代謝途徑的分析顯示MeLCYB跟塊根類胡蘿卜素積累相關(guān)性最大[20]，而本次試驗(yàn)結(jié)果顯示組培苗與前期塊根的研究結(jié)果有差異，幾乎所有類胡蘿卜素代謝的相關(guān)基因在TM60444的根莖葉中相對(duì)表達(dá)量都是呈遞增趨勢(shì);而在SC9的根莖葉中則都呈現(xiàn)不變或者遞減的表達(dá)關(guān)系。可能是由于不同的組織，植物品種和組織多樣性導(dǎo)致。胡蘿卜素和葉黃素之間存在轉(zhuǎn)化關(guān)系，如SC9葉片中胡蘿卜素含量低于TM60444，而葉黃素含量則相反，但兩個(gè)品種中總類胡蘿卜素含量是接近的。本研究結(jié)果表明不同品種木薯組培苗不同組織類胡蘿卜素等含量基本一致。

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