番茄棒孢葉斑病病原鑒定及生物學特性研究

田守波 朱為民 朱龍英 楊學東 張迎迎 張輝 劉娜

摘要 本研究采用PSA培養基對上海地區的番茄棒孢葉斑病的病原菌進行分離、培養及致病性測定，通過形態學和分子生物學方法鑒定病原菌，并對該病菌的生物學特性進行研究。結果表明：番茄棒孢葉斑病病原菌菌落呈灰褐色，菌絲質地致密、絨毛狀;分生孢子單生或串生，圓柱形或倒棍棒形、頂端鈍圓，基部平截，呈半透明至淺褐色，假隔膜4～10個，直或稍彎曲，基臍加厚，深褐色。結合病原菌rDNA ITS序列測定、比對后，確定該病原為多主棒孢Corynespora cassiicola。該病菌的菌絲生長最適溫度為25～30℃，最適pH范圍為4～8，產孢的最適溫度約為25℃，最適pH范圍為5～9，麥芽糖和乳糖為碳源的培養基適宜菌絲生長，可溶性淀粉和乳糖溶液中孢子萌發率最高，光暗交替條件適宜菌絲生長，孢子在水滴中極易萌發。這是該病在上海地區的首次報道。

關鍵詞 番茄棒孢葉斑病; 多主棒孢; 病原鑒定; 生物學特性

中圖分類號： S 436.412

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019091

Identification of the pathogen from Corynespora leaf spot of tomato and

research on its biological characteristics

TIAN Shoubo， ZHU Weimin， ZHU Longying， YANG Xuedong， ZHANG Yingying， ZHANG Hui， LIU Na

（The Protected Horticulture Institute， Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai

Key Laboratory of Protected Horticultural Technology， Shanghai 201403， China）

Abstract

In this study， PSA was used to isolate， culture and test the pathogen of Corynespora leaf spot of tomato in Shanghai. Morphological and molecular biological methods were used to identify the pathogen， and its biological characteristics were studied. The results showed that the colony of the pathogen was grayish brown with dense and villous hyphae; conidia were solitary or connate， cylindrical or inverted rod-shaped， obtuse-rounded at the top， flat at the base， translucent to light brown; pseudomembranes were 4-10， straight or slightly curved， and basal umbilicus was thicker and dark brown. Combined with rDNA ITS sequence analysis and comparison， the pathogen was identified as Corynespora cassiicola. The optimum temperature for mycelial growth and sporulation of the pathogen was 25-30℃ and 25℃， respectively. The optimum pH value was 4-8 and 5-9 respectively. The medium with maltose and lactose as carbon source was suitable for mycelial growth. The spore germination rate in soluble starch and lactose solution was the highest. The alternating light and dark conditions were suitable for mycelial growth and spores germinate easily in water droplets. This was the first report of the disease in Shanghai.

Key words

Corynespora leaf spot of tomato; Corynespora cassiicola; pathogen identification; biological characteristics

番茄棒孢葉斑病（Corynespora leaf spot of tomato）又稱斑點病，主要危害番茄的葉片和莖稈。該病由棒孢屬Corynespora Gussow真菌引起，最早于1906年在黃瓜上發現，隨后東南亞的印度、馬來西亞、印度尼西亞、斯里蘭卡等國家橡膠樹上普遍暴發棒孢霉葉斑病，該病現已成為威脅世界橡膠產業發展的重要病害[12]。隨著病原菌的廣泛傳播，寄主范圍也變得廣泛，例如番茄[3]、黃瓜[4]、辣椒[5]、苦瓜[6]、紫蘇[7]、一品紅[8]、大豆[9]等。我國最早在豇豆上發現由多主棒孢引起的豇豆棒孢葉斑病，而后發現該病菌可侵染黃瓜，但并未引起重視[10]。在很長一段時間內，棒孢葉斑病被列為次要病害。然而，由于病原菌具有寄主廣泛、侵染破壞力強、傳播途徑多樣的特點，再加上蔬菜設施栽培面積逐年增加，設施內溫濕度條件促進了病原菌滋生，棒孢葉斑病發病越來越重，尤其是我國東北、華北和華東等設施蔬菜種植面積大的地區棒孢葉斑病發生尤為嚴重[11]。番茄棒孢葉斑病最早于1982年在北美等熱帶地區暴發，隨后在南美、韓國、日本相繼發生[12]。該病在我國北京、山東、河北、浙江、海南等地均有發生，嚴重影響我國番茄的產量和品質[11]。但是，至今在上海地區還未有關于番茄棒孢葉斑病的報道。

迄今，我國關于番茄棒孢葉斑病的研究大多集中在病害發現和病原菌鑒定等方面[1314]。與黃瓜、橡膠、茄子等其他作物相比，番茄棒孢葉斑病方面的研究還不夠深入和系統，有關病原菌孢子萌發、菌絲生長等相關生物學特性方面的報道還很少見。2017年9月，課題組在上海市奉賢區莊行鎮番茄種植溫室里發現番茄棒孢葉斑病病葉，立即取樣帶回實驗室進行分離、鑒定。因此，本試驗通過對上海奉賢地區番茄棒孢葉斑病的病原菌進行分離、鑒定和rDNA ITS序列分析，從而明確上海地區番茄棒孢葉斑病病原菌的種類，并進一步研究病原菌孢子萌發和菌絲生長等特性，探討病原菌的相關生物學特性，為番茄棒孢葉斑病的病原學研究提供依據，也為該病在上海地區的生態學防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病害觀察及病樣采集

2017年9月在上海市奉賢區莊行鎮大棚栽培的番茄中采集具有典型特征的番茄葉片，記錄癥狀、拍照后，帶回實驗室做進一步分離。

1.2 分離

病樣洗凈后置于自來水下沖洗1～2 h，晾干后將病健交界處組織切成3～4 mm小塊，在0.5%有效氯的次氯酸鈉液中消毒3～5 min，取出后用無菌水清洗1～2次，無菌條件下吹干后置于馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）上，25℃、黑暗條件下培養[1516]。

1.3 致病性鑒定

將純化的菌株SH17-159接到液體培養基（PS）中，于25℃，130 r/min條件下振蕩培養7 d后，用雙層紗布過濾、離心，用無菌水配成孢子含量為1×106個/mL的菌懸液。采用噴霧法接種番茄葉片，接種后套袋保濕24 h后揭膜恢復正常生長條件，設置3次重復，每次重復20株。待接種植株發病后調查發病情況，并從發病部位進行病原菌再分離[13，16]。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態觀察

將分離的病菌接種到PSA平板上，25℃黑暗條件下培養，定期觀察記錄菌落形態和顏色，孢子形成后通過顯微鏡觀察分生孢子形態。

1.4.2 分子鑒定

通過改良CTAB法提取病原菌的基因組DNA[17]。采用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），對DNA進行PCR擴增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增條件為：94℃預變性3 min;94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環;72℃保溫20 min[1516]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用回收試劑盒回收得到擴增產物，將純化的PCR產物委托基康生物技術有限公司測序。測得的DNA序列通過BLAST進行比對，查找同源性最高的病原菌序列。

1.5 不同條件對孢子萌發的影響

1.5.1 溫度對孢子萌發的影響

將平板培養基上產生的分生孢子用無菌水洗下，配成低倍鏡下每視野20～30個孢子的孢子懸浮液，滴于凹面載玻片上，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45℃條件下保濕培養12 h，然后鏡檢，并計算孢子萌發率[18]。每處理設置3次重復。

1.5.2 pH對孢子萌發的影響

用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調配pH 2～12的緩沖液，分別配制孢子懸浮液，25℃保濕培養，12 h后鏡檢并統計孢子萌發率。每處理設置3次重復。

1.5.3 濕度對孢子萌發的影響

用濃硫酸在干燥器中調節濕度范圍為15%、30%、45%、60%、75%、90%。將孢子懸浮液涂在載玻片上放入容器中，25℃培養12 h后調查孢子萌發率。以水滴中的孢子萌發率為對照。

1.5.4 碳源對孢子萌發的影響

用無菌水配制2%可溶性淀粉溶液、2%麥芽糖溶液、2%乳糖溶液、2%甘露醇溶液、2%葡萄糖溶液和2%果糖溶液，分別配制孢子懸浮液，滴于載玻片上，25℃培養12 h后統計各處理的孢子萌發率。

1.6 不同條件對菌絲生長的影響

1.6.1 溫度對菌絲生長的影響

用打孔器取直徑0.6 cm的菌塊置于PSA培養基上，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45℃條件下恒溫培養，7 d后用十字交叉法測定菌落直徑。每處理重復3次。

1.6.2 pH對菌絲生長的影響

用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調配pH 2～12的培養基，取直徑0.6 cm的菌塊于PSA培養基上，25℃恒溫培養，7 d后用十字交叉法測定菌落直徑。每處理重復3次。

1.6.3 光照對菌絲生長的影響

用打孔器取直徑0.6 cm的菌塊置于PSA培養基上，分別置于連續光照、12 h明暗交替、完全黑暗3種光照條件，25℃恒溫培養，7 d后測量菌落直徑，每處理3次重復。

1.6.4 碳源對菌絲生長的影響

以PSA為基礎培養基，將其中的蔗糖以可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖和果糖等量替換，即成含糖量相同而碳源不同的培養基，滅菌后接種，25℃恒溫培養，7 d后測量菌落直徑，每處理3次重復。

1.7 數據統計與分析

采用Excel 2010及DPS軟件進行數據處理，并利用Duncan氏新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀及致病性鑒定

田間以危害番茄葉片為主，葉正、背面均可受害。發病初期葉片出現深褐色小點，病斑2～3 mm時近似圓形，病斑質薄呈半透明狀，中央或者近中央仍有直徑2～3 mm黃褐色斑點，似靶心，周圍有黃色暈圈，病健界限明顯;中期病斑逐漸擴大，呈圓形、多角形或不規則形，深褐色;發病后期病株變黃，葉片脫落（圖1a）。純化菌株SH17-159接種番茄葉片6 d后開始發病，癥狀與田間觀察相似，重新分離可得到相同的病原菌。

2.2 病原菌形態學特征

菌落在PSA平板上呈灰褐色，菌絲質地致密、絨毛狀（圖1b）。分生孢子單生或串生，圓柱形或倒棍棒形、頂端鈍圓，基部平截，呈半透明至淺褐色，假隔膜4～10個，直或稍彎曲，大小（32～189.5）μm×（6～16）μm，基臍加厚，深褐色，寬4～7 μm（圖1c、1d），分生孢子梗較粗，圓柱狀，有橫隔，具有多層出梗（圖1e）。

2.3 病原菌分子鑒定

菌株SH17-159的rDNA ITS序列經PCR擴增，得到520 bp左右的片段。測序后，獲得512 bp的序列（圖2）。通過NCBI GenBank進行BLAST相似性比對，與多主棒孢Corynespora cassiicola（FJ852699、EF198117）的相似性達98%以上（圖3）。結合形態學鑒定結果，引起上海地區設施栽培番茄葉片上棒孢葉斑病的病原為多主棒孢C.cassiicola。

2.4 不同條件對孢子萌發的影響

2.4.1 溫度對孢子萌發的影響

由圖4可知，多主棒孢分生孢子在溫度為5℃時不萌發，10～45℃范圍內均可萌發。20～35℃為適宜萌發溫度范圍，孢子萌發率超過75%;最適宜溫度為25℃，萌發率達85%;低于20℃和高于35℃孢子萌發受到明顯抑制，當溫度為45℃時，萌發率僅為3%。

2.4.2 pH對孢子萌發的影響

從圖5可以看出，在試驗選取的pH范圍內，分生孢子均可萌發。當pH為2～7時，隨著pH升高，孢子萌發率增加，當pH增加到7時，萌發率最高，為90%;而后隨著pH增大，萌發率略有降低。可見，孢子對堿性條件的適應性較強，較強酸性條件不利于孢子萌發。

2.4.3 濕度對孢子萌發的影響

當濕度低于75%時，孢子不萌發（圖6）。當濕度為90%時，孢子萌發率僅為2%;而水滴對照中孢子萌發率為87%。說明水是孢子萌發的必需條件。

2.4.4 碳源對孢子萌發的影響

如圖7所示，孢子在可溶性淀粉溶液和乳糖溶液中萌發率最高，分別為88.2%和85.6%，以下依次為麥芽糖溶液、甘露醇溶液、葡萄糖溶液，在果糖溶液中的萌發率最低，僅為28.5%。

2.5 環境條件對菌絲生長的影響

2.5.1 溫度對菌絲生長的影響

溫度對菌絲生長影響見圖8。菌落在5～45℃范圍內均可生長，其中，25～30℃時生長最快，為適宜生長溫度范圍。當溫度低于5℃或高于45℃時，菌落生長緩慢。

2.5.2 pH對菌絲生長的影響

由圖9可知，病菌對酸堿條件的適宜范圍較廣，當pH為2～12時，菌絲均可生長。適宜pH范圍為4～8。當pH小于4或者大于8時，菌絲生長速度減慢。

2.5.3 光照對菌絲生長的影響

從圖10可以看出，在明暗交替條件下菌落直徑大于連續光照和全黑暗條件，為4.88 cm，而連續光照條件下菌落直徑極顯著低于其他兩個處理，菌落直徑最小，為4.32 cm。可見，適當光照有利于菌絲生長。

2.5.4 碳源對菌絲生長的影響

多主棒孢菌絲可以在多種碳源上生長（圖11）。在以麥芽糖為碳源的培養基上菌絲生長最快，菌落直徑為6.00 cm，其次為乳糖，菌落直徑為5.72 cm;菌絲在以甘露醇、葡萄糖和可溶性淀粉為碳源的培養基上生長差異不顯著，菌落直徑在5.22～5.40 cm之間。病菌對果糖的利用能力最低，菌落直徑僅為3.90 cm，該結果與碳源對孢子萌發影響相似。

3 結論與討論

多主棒孢C.cassiicola （Berk. & Curt.）Wei隸屬于半知菌亞門Deuteromycotina絲孢綱Hyphomycetes絲孢目Hyphomycetales暗色菌科Dematiaceae棒孢屬Corynespora Gussow，是棒孢屬內發現最早、寄主范圍最廣的種。據統計，380個屬530余種植物均可被其侵染，包括橡膠、黃瓜、茄子、豇豆、木瓜、木薯等作物，每年造成巨大經濟損失[4，11]。由多主棒孢引起的葉斑病已成為我國一種重要的流行病害。番茄棒孢葉斑病易與灰葉斑病、炭疽病等病害混淆，并且傳播和發病速度快，早期容易因誤診而錯過最佳防治時期，造成經濟損失。

對于植物病原真菌，傳統上采用觀察菌落形態、分生孢子形態等進行形態學鑒定。目前，人們在形態學觀察的基礎上，借助PCR分子鑒定技術，對病原真菌進行準確、高效的鑒定，有效避免了傳統鑒定中由于人為因素導致的誤判。陳璐[19]建立了黃瓜寄主上多主棒孢菌PCR檢測體系，并根據33種不同寄主上多主棒孢與其他主要真菌病原菌ga4基因序列差異，設計特異性引物ga4F1/ga4R1，建立了多主棒孢的熒光定量PCR檢測技術。曾蓉等[15]在形態學觀察的基礎上，通過對病原菌rDNA ITS序列測定、比對，確定上海地區黃瓜葉片出現的靶斑病病原為多主棒孢。高葦等[20]采用形態學觀察和分子生物學方法對危害遼寧、山東茄子棒孢葉斑病的病原菌進行了鑒定，確定該病的病原菌為多主棒孢。

本研究通過觀察菌落和孢子形態，發現引起上海地區番茄葉片棒孢葉斑病的病原菌與杜公福等[14]對海南地區櫻桃番茄葉斑病的病原形態學鑒定結果相似。本研究結果中菌落呈灰褐色，分生孢子大小（32～189.5）μm×（6～16）μm，而海南地區櫻桃番茄葉斑病病原菌的菌落呈灰褐色至黑色，分生孢子稍大些，為（38～216）μm×（8～21）μm。進一步對病原菌rDNA ITS序列測定、比對后，確定該病原為多主棒孢，與我國報道的海南木薯、黃瓜上的多主棒孢相似性在98%以上。這是該病在上海地區的首次報道。

本研究中，番茄多主棒孢菌絲生長最適溫度為25～30℃，最適pH值范圍為4～8，產孢的最適溫度約為25℃，最適pH值范圍為5～9，麥芽糖和乳糖為碳源的培養基更有利于菌絲吸收，可溶性淀粉和乳糖溶液中孢子萌發率最高，而以果糖為碳源不利于孢子萌發和菌絲生長，光暗交替條件適宜菌絲生長，孢子在水滴中極易萌發，該結果與劉鳴韜等[21]在黃瓜靶斑病菌和張春霞等[22]在橡膠樹棒孢霉落葉病上的報道一致。從病原菌生物學特性可以看出，該病菌具有喜溫好濕的特點，高溫、高濕有利于該病的流行和蔓延[23]。上海氣候溫暖濕潤，尤其夏季梅雨氣候，有利于番茄棒孢葉斑病的發生。另外，番茄棒孢葉斑病病殘體上的分生孢子及菌絲均可在保護地內安全越夏，成為下茬番茄的初侵染源，這些因素可能是導致該病發生的重要原因之一。

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（責任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190228?? 修訂日期： 20190416

基金項目：上海市農委青年人才成長計劃項目（滬農青字（2018）第1-15號）;上海市科技興農項目（滬農科推字（2019）第3-1號）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者E-mail：張輝zhanghui@saas.sh.cn;劉娜yyliuna@163.com

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