新疆棉花枯、黃萎病的發生現狀及其快速分離技術

2020-06-08 10:55:23張國麗謝宗銘馮自力李全勝朱荷琴呂寧孫國清

植物保護 2020年3期

張國麗謝宗銘馮自力李全勝朱荷琴呂寧孫國清

摘要為明確新疆不同地區造成棉花萎蔫，維管束變褐的病原菌種類及其發生現狀，本研究對新疆47個主要植棉區有萎蔫癥狀且維管束變褐的棉花病株進行了分離鑒定，并對其快速分離鑒定方法進行了改進。結果表明：南疆20個地點，得到358個純化菌株，黃萎病菌占81.8%，枯萎病菌占18.2%;北疆27個地點，得到495個純化菌株，黃萎病菌占93.9%，枯萎病菌占6.1%。南北疆均以黃萎病為主，枯萎病南疆重于北疆。維管束病害的快速分離方法每分離一個樣品只需2 min，污染率僅為6.7%。

關鍵詞棉花; 黃萎病; 枯萎病; 快速分離鑒定方法

中圖分類號： S 435.621.2

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019092

Occurrence of cotton Fusarium and Verticillium wilt in Xinjiang and the rapid isolation method

ZHANG Guoli1， XIE Zongming1， FENG Zili2， LI Quansheng1， ZHU Heqin2， L Ning1， SUN Guoqing1，3

（1. Xinjiang Production & Construction Group Key Laboratory of Crop Germplasm Enhancement and

Gene Resources Utilization， Biotechnology Research Institute， Xinjiang Academy of Agricultural and

Reclamation Sciences， Shihezi 832003， China; 2. State Key Laboratory of Cotton Biology， Institute of

Cotton Research， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Anyang 455000， China; 3. Biotechnology

Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract

In order to identify the species and the occurrence of the pathogen which cause cotton wilting and vascular browning， cotton wilting and vascular browning plants collected from 47 main cotton planting areas in Xinjiang were separated and identified. And the isolation method was also improved. The result showed that 358 purified strains were obtained from 20 sites in South Xinjiang， Verticillium dahliae accounting for 81.8%， and Fusarium oxysporum for 18.2%. 495 were obtained from 27 sites in Northern Xinjiang， V.dahliae accounting for 93.9%， and F.oxysporum for 6.1%. Fusarium wilt in South is more serious than that in North Xinjiang. The improved isolation method only needed 2 min and its contamination rate was only 6.7%.

Key words

cotton; Verticillium wilt; Fusarium wilt; rapid isolation method

新疆是我國最大的優質棉生產基地，近年來由于高密度栽培、寬膜覆蓋、膜下滴灌等新技術的應用，使得棉花單產、品質等得到大幅度提高，但各種病蟲害也逐漸加重，特別是土傳病害枯、黃萎病危害尤為明顯。

棉花枯萎病病原菌為尖鐮孢萎蔫專化性Fusarium oxysporum f. sp. vaxinfectum （Atk.） Synder and Hansen，屬半知菌亞門鐮孢屬，該病原菌分布于土壤層60 cm以上且在土壤中可存活6～7年。病菌在浸水條件下容易死亡[12]。該病最早于1891年在美國發現[3]，20世紀70-80年代初期，隨棉種的大量調運，該病遍布于全國各主要產棉區，每年因此病損失皮棉約200萬擔[2]。20世紀80年代中后期，抗病品種開始大量推廣，該病在我國主要產棉區得到了控制，但長絨棉枯萎病仍然很嚴重。陸地棉枯萎病也時有發生，且個別地塊特別嚴重，仍是棉花生產上一個重要的問題[4]。

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌Verticillium dahliae Kleb.引起的土傳維管束病害，可嚴重影響棉花的品質和產量，是制約新疆棉花生產的主要障礙之一，發生嚴重時可導致減產80%[5]。該病原菌可侵染200余種經濟作物，是世界性的重大植物病害[67]。大麗輪枝菌的微菌核抵抗不良環境能力強，可以在沒有寄主的條件下存活十幾年之久[8]，在0～20 cm的土壤中成聚集或均勻分布[9]。棉田中的黃萎病菌是一個混合基因型群體[10]，易于變異，防治困難。在生產上，抗黃萎病育種工作的進展與棉花生產的要求還有很大的差距[11]。棉花枯萎病和黃萎病都屬于土傳維管束病害，都可產生萎蔫癥狀，有的同株混發，難以區分。因此，明確新疆棉花維管束病害發生的現狀，以及新疆棉花上致病菌的類型對于棉花病害防治具有非常重要的意義。

維管束病害分離采用常規組織分離法，該方法耗時費力，因此本研究對其分離方法進行了改進，加速了病原菌分離的速度，為棉花枯、黃萎病后期深入系統研究奠定堅實基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本課題組于2016年-2017年5月至10月從新疆主要植棉區（包括新疆維吾爾自治區和新疆建設兵團）采集有萎蔫癥狀的棉花病株，每個地塊10～20株并觀察記錄植株發病癥狀。

1.2 試驗方法

1.2.1 常規組織分離法和改進方法比較

本試驗對維管束病害的分離方法進行了改進，并比較改進和常規組織分離方法的優缺點，每種方法檢測樣品都為30株有萎蔫癥狀的棉花植株，樣品采自145團多年連作的棉花重病田。

常規組織分離方法：以5%次氯酸鈉作為消毒劑。（1）用修枝剪將棉稈剪成10 cm左右的小段，用75%酒精棉擦拭干凈;（2）在盛有75%乙醇的培養皿中浸泡5 min，然后5%次氯酸鈉消毒5 min，75%乙醇再浸泡5 min，無菌水沖洗4遍，滅菌濾紙吸干殘余液體，將棉稈剪成0.5 cm左右的小段于滅菌培養皿中，然后用滅菌鑷子將小段插在PDA平板上，每平板5個，為防止交叉污染，每分離1個樣品，需要換1套器皿;（3）待培養基上的小段棉稈長出菌絲時，用接種環刮取少量菌絲于放有200 μL無菌水的離心管中，振蕩搖勻，制成孢子和菌絲懸浮液，用滅菌的接種環蘸取懸浮液在新的PDA平板上劃線，于26℃黑暗培養2～3 d;（4）用接種針挑取單菌落接到新的PDA培養基中央，26℃黑暗培養15 d，病原菌長至直徑為6 cm的菌落，為純化菌株。

改進方法：（1）用滅菌的修枝剪將兩節果枝之間表皮無損傷的棉稈截成10 cm的小段;（2）以下操作在無菌操作臺中進行：用75%酒精棉擦棉稈兩次，然后捏住棉稈一段，將棉稈剝皮，剝皮時注意不要碰觸已經剝皮部分，用滅菌的修枝剪減去頭端，然后將剩余剝皮部分剪成0.5 cm左右的小段于滅菌培養皿中，用滅菌鑷子將小段棉稈部分埋進培養基，每皿放5個小段，26℃黑暗培養3～4 d，之后步驟同1.2中的（2）和（3）。

1.2.2 新疆不同地區棉花病株的分離鑒定

采用1.2.1中的改進方法對新疆不同地區的棉花病株進行分離鑒定。

1.3 數據處理

利用Excel 2007進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 棉花枯、黃萎病田間主要癥狀

棉花枯萎病主要出現在苗期，癥狀與環境條件有一定關系。新疆早春氣溫較低，較易出現紫紅型，葉片變紫紅色或呈紫紅色的斑塊，以后逐漸萎蔫、枯死、脫落（圖1 a）;黃色網紋型子葉或真葉的葉脈局部或全部褪綠，葉肉仍保持綠色，隨后逐漸枯死脫落（圖1 b）;矮縮型植株矮化，節間縮短，頂葉發生皺縮、畸形（圖1 b、c）;黃化型多從葉尖或葉緣開始，局部或全部褪綠變黃，也伴有矮縮現象，隨后逐漸變褐枯死或脫落（圖1 c、d）。不同癥狀類型有時同時出現，例如黃色網紋型和矮縮型，黃化型和矮縮型等。剖稈檢查，維管束有變褐現象。

棉花黃萎病：田間表現最多的為普通型，感病初期葉片葉肉失綠，黃綠相間斑駁成塊，葉片挺而不萎;當病害進一步發展，葉肉間出現不規則嵌狀病斑，主脈仍保持綠色，病葉向上蜷曲，呈掌狀斑駁（“花西瓜皮”狀）（圖2 a），嚴重時葉片焦枯（圖2 b）。棉花黃萎病在田間的癥狀有時表現為多數或全株葉片萎蔫下垂，夏季暴雨過后也會出現急性青萎（圖2 c），病葉似開水燙傷狀萎蔫，后轉為褐色枯死，葉片向上蜷曲呈勺狀，很快脫落呈光稈（圖2 d）。剖稈檢查時，維管束都有變褐現象。

2.2 新疆棉花枯、黃萎病菌的發生情況

2016-2017年每年5月至9月，我們對新疆主要植棉區的陸地棉有萎蔫癥狀的病株進行分離鑒定，涉及47個植棉縣市、團場。分離結果表明，陸地棉主要是黃萎病，但枯萎病也時有發生，個別地塊還特別嚴重。在分離鑒定的911株棉花病株中，853個樣品都得到了純化病原菌株，占總樣品的93.6%。枯萎病菌占純化菌株的11.1%，黃萎病菌占88.9%。南疆涉及20個地點，共檢測了391株病株，得到358個純化菌株，枯萎病菌占18.2%，黃萎病菌占81.8%;北疆涉及27個地點，共檢測了520株病株，得到495個純化菌株，枯萎病菌占6.1%，黃萎病菌占93.9%。從達勒特鎮（博爾塔拉蒙古自治州棉花抗病品種選育基地，連續種植棉花30年）和145團（新疆惠遠種業病圃地）采集的樣品中都可以分離出枯萎病菌和黃萎病菌，說明這兩個天然病圃均為枯、黃萎病混發。達勒特鎮病圃分離的枯萎病菌占20.0%，黃萎病菌占80.0%;145團惠遠病圃地分離的枯萎病菌占30.0%，黃萎病占70.0%。南疆枯萎病發生要比北疆重，且有明顯的地域特征，主要集中于農二師29團、30團和31團，所檢測的病株均為枯萎病，占南疆枯萎病總檢測株數的76.9%;農一師11團和12團枯萎病分別占檢測菌株的50.0%和25.0%。具體分離情況見表1。北疆枯萎病零星發生，主要為黃萎病。

2.3 棉花枯、黃萎病改進分離方法與常規組織分離方法比較

針對枯、黃萎病菌維管束病害分離鑒定速度慢、消毒步驟繁瑣、易污染等問題，本試驗改進了分離方法。改進方法每分離一個樣品只需2 min，30株病株經分離純化后，除2個皿有雜菌污染外，其余均無污染，污染率6.7%，得到28個純化菌株，占93.3%（圖3 a），實際應用中的純化率為93.6%（表1），說明該方法準確可靠，實用性強。常規組織分離方法每分離一個樣品需要15～20 min，分離的30株病株中，21個皿有其他雜菌污染，污染率70.0%，9個無其他雜菌污染，占30.0%。單孢純化的菌株有12株，占40.0%（圖3 b）;為防止交叉污染，消毒處理時每個樣品都要用單獨的滅菌容器進行滅菌、無菌水沖洗，無菌濾紙吸干殘留的液體，每個樣品至少需要8個器皿，而改進方法只需要一個;改進方法所需時間為常規組織分離方法的1/10，純化率卻比常規組織分離方法高53.3百分點，提高了1倍以上。

3 討論

3.1 新疆棉花枯、黃萎病發生情況

棉花枯萎病一般在苗期或現蕾期出現發病高峰，現蕾期是植株抗病性發生的轉折點，前期抗病性較弱，后期抗病性增強[12]。南疆棉花調查時間集中于7月中旬，此時個別條田枯萎病仍然發生嚴重。從調查結果可以看出，陸地棉枯萎病主要發生于南疆地區，與繆衛國和田逢秀報道的結果一致[13]。枯萎病發生具有明顯的地域特征，主要集中于農二師的29團、30團和31團，農一師11團和12團也有發生。1997年以后隨著陸地棉抗病品種的引進和本地高抗枯萎病品種的育成，陸地棉的枯萎病基本得到控制[4]，但仍然有零星發生，個別條田發生嚴重。因此，病原菌可能仍然存活于條田中或種子帶菌。隨著連年耕作，棉花品種的更換，氣候條件的變化，選擇壓力的增加，病原菌本身發生變異或生理小種優勢群體的變化，使得個別條田枯萎病發生嚴重，該問題仍然值得注意。

石河子地區2008年棉花黃萎病發病面積30%以上，比2001年增加了857.8%[14]。劉海洋等[15]對新疆主要棉區黃萎病進行了調查，在調查的79塊棉田中，有黃萎病發生的病田占比為87.3%，其中棉花黃萎病發生程度為中度以上病田占比為48.1%，嚴重發生病田占到24.1%，甚至部分調查棉田棉花黃萎病發病率高達80%（143團）。本研究在檢測的911株萎蔫病株中，黃萎病菌占到88.9%，北疆地區更是占到了93.9%，棉花黃萎病仍然是陸地棉上的主要病害，這些病原菌株的致病力、變異情況等還有待進一步研究。

從達勒特鎮病圃地（博爾塔拉蒙古自治州棉花抗病品種選育基地，連續種植棉花30年）和145團（新疆惠遠種業病圃地）采集的樣品中都可以分離出枯萎病菌和黃萎病菌。因此，自然條件下的病圃一般為枯、黃萎病混發，但人工病圃也不能完全排除混發的可能。在鑒定一個品種的抗性時，對枯、黃萎病都達到耐或抗的條件，才能評價這個品種是耐病或抗病品種。雖然這樣選擇出來的品種對兩種病害都達到了耐或抗，更接近育種家和種植者的目的，但這種情況可能會淘汰一些高抗或耐一種病害的品種，造成種質資源的流失。

3.2 棉花枯、黃萎病菌分離方法

棉花苗期主要病害為枯萎病，在棉花現蕾后，棉花發生的枯、黃萎病就難以區分，給調查的準確性帶來了一定的挑戰，研究人員在調查時因受試驗條件及人力限制，基本混在一起調查。本試驗通過改進組織分離鑒定方法，極大地縮短了病菌分離時間，同時也減少了繁瑣的步驟，分離純化率非常高，可快速分離鑒定兩種病原菌。但改進方法必須是新鮮樣品，若不能及時分離可在4℃存放3～4 d。因該方法簡單易操作，采樣路途遙遠時也可在簡單的酒精燈火焰無菌環境周圍隨時對病株進行分離。

常規組織分離方法[1618]耗時費力，有時還需要流水沖洗30 min以上。消毒時需無菌器皿繁多，容易混亂。消毒處理后無菌水沖洗，殘留液體需要滅菌濾紙吸干，否則影響病原菌的生長。升汞有劇毒，雙氧水或次氯酸鈉等也都有腐蝕性，因此操作要十分謹慎。但常規組織分離方法可以分離晾干的樣品，不能及時分離時可將樣品在通風處晾干（避免暴曬或不透氣），保存，后期需要時再做分離。因此，如果需要大量采集樣品做研究時，兩種方法可結合使用，提高工作效率，加快研究速度。

本試驗采用改進方法分離維管束病害時，采用的新鮮樣品，選取表皮沒有破損的地方，只用乙醇對表面進行了簡單處理，對維管束沒有做任何消毒處理，分離的病原菌純度非常高，很少有其他細菌或真菌污染，說明維管束中內生菌是非常少的。常規組織分離方法采用的也是新鮮樣品，但沒有做去皮處理，分離的樣品純度都比較低。一是可能消毒不夠徹底，表皮一些頑固性微生物仍有存活，或在分離過程中造成了污染。因此采用常規組織分離方法時一定要及時更換消毒和沖洗器皿;二是可能木本類植物內生菌主要存在表皮組織中，維管束中非常少。因此在研究木本類植物內生菌時，可根據需要，選擇合適的部位進行分離。此外，可能因為維管束中內生菌非常少，病原菌侵入之后沒有競爭壓力，沒有與之相拮抗的微生物，加之品種抗病性弱時，一旦侵染成功對植物來說就是毀滅性的，這可能也是棉花黃萎病難以防治的原因之一。

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（責任編輯：楊明麗）