JWH133對MPP+誘導的原代星形膠質細胞COX-2和iNOS表達的影響

賈翼 鄧晗 馬澤剛

[摘要] 目的 探討大麻素Ⅱ型受體（CB2受體）激活對1-甲基-4-苯基-吡啶離子（MPP+）誘導原代星形膠質細胞炎癥反應的影響。方法 培養原代星形膠質細胞，生長狀態良好時將其分為Control組、MPP+組、JWH133（CB2受體激動劑）+MPP+組、AM630（CB2受體抑制劑）+JWH133+MPP+組。應用免疫印跡法（Western Blot）檢測Control組和MPP+組細胞CB2受體蛋白的表達。應用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測各組環氧化酶2（COX-2）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因的表達。結果 與Control組相比，MPP+組的CB2受體蛋白表達上升（F=29.78，P<0.01）。與Control組比較，MPP+組COX-2和iNOS基因的表達明顯上調（F=22.59、11.27，q=10.13、5.57，P<0.01）;JWH133預處理抑制MPP+誘導的COX-2和iNOS基因表達的上調（q=6.26、4.16，P<0.05）;此抑制作用可被AM630所阻斷（q=5.34、5.67，P<0.01）。結論 激活CB2受體可抑制MPP+誘導的原代星形膠質細胞炎癥反應。

[關鍵詞] 受體，大麻酚，CB2;大麻素受體激動劑;1-甲基-4-苯基吡啶;星形細胞;環氧化酶2;一氧化氮合酶Ⅱ型

[中圖分類號] R338.2 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）02-0156-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.071 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0907.003.html;2020-04-18 15：26

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of cannabinoid 2 receptor （CB2 receptor） on 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+）-induced inflammatory response in primary cultured astrocytes. ?Methods Primary cultured astrocytes were cultured and divided into Control group， MPP+ group， JWH133 （CB2 receptor agonist）+MPP+ group， and AM630 （CB2 receptor antagonist）+JWH133+MPP+ group when growing well. Western blotting was used to determine the protein expression of CB2 receptor in Control group and MPP+ group. Quantitative real-time PCR was performed to measure the mRNA expression of cyclooxygenase-2 （COX-2） and inducible nitric oxide synthase （iNOS）. ?Results Compared with Control group， the MPP+ group had significantly up-regulated CB2 receptor protein expression （F=29.78，P<0.01） and significantly up-regulated COX-2 and iNOS mRNA expression （F=22.59，11.27;q=10.13，5.57;P<0.01）. JWH133 pre-treatment significantly inhibited the up-regulated mRNA expression of COX-2 and iNOS induced by MPP+ （q=6.26，4.16;P<0.01）， while this was blocked by CB2 receptor antagonist AM630 （q=5.34，5.67;P<0.01）. ?Conclusion Activation of CB2 receptor can inhibit MPP+-induced inflammatory response in primary cultured astrocytes.

[KEY WORDS] receptor， cannabinoid， CB2; cannabinoid receptor agonists; 1-methyl-4-phenylpyridinium; astrocytes; cyclooxygenase 2; nitric oxide synthase type Ⅱ

星形膠質細胞是中樞神經系統中數量最多的一類神經膠質細胞，它們在維持細胞外液動力學、調節神經遞質代謝、促進神經再生和修復中起重要的作用[1]，在帕金森?。≒D）的發生發展中也具有重要作用[2]。PD是一種常見的神經變性疾病，其病理特征為黑質致密部多巴胺（DA）能神經元的選擇性缺失[3]。神經炎癥則是PD神經變性的主要因素之一[4]。在病理情況下，過度活化的星形膠質細胞釋放一系列炎性遞質，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、環氧化酶2（COX-2）[5]和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）等，可以引起神經炎癥[6]，并激活小膠質細胞繼續釋放炎性遞質加重神經炎癥，從而誘導神經元死亡[7-8]。因此，有效抑制星形膠質細胞的活化和炎性因子的釋放對于PD的治療有重要意義。大麻素Ⅱ型受體（CB2受體）是一種G蛋白耦聯受體[9]，大量研究表明CB2受體在中樞神經系統疾病的發病中起重要作用[10-11]。關于CB2受體治療神經炎癥反應的研究已經取得了一定進展。有研究證實，WIN55、212-2（合成CB1/2受體激動劑）和JWH133（選擇性CB2受體激動劑）[12]通過激活小膠質細胞CB2受體抑制脂多糖[13]和β-淀粉樣蛋白[14]誘導的TNF-α和一氧化氮（NO）的產生;在動物實驗中激活膠質細胞CB2受體可以通過抑制炎癥反應來保護DA能神經元[15-16]。CB2受體不僅在小膠質細胞中表達，在星形膠質細胞和神經元中也有表達[17]，但目前缺少關于星形膠質細胞中CB2受體的研究。目前尚不清楚JWH133能否通過選擇性激活CB2受體抑制星形膠質細胞的炎癥反應。本研究應用1-甲基-4-苯基-吡啶離子（MPP+）制備原代星形膠質細胞的炎癥模型，觀察JWH133對MPP+誘導的COX-2和iNOS基因表達的影響，以及CB2受體拮抗劑AM630的阻斷效應，確定JWH133激活星形膠質細胞CB2受體是否具有抗炎作用，從而為PD的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

二甲基亞砜（DMSO）、MPP+購自美國Sigma-Aldrich公司;DEMED/F12培養液購自美國Hyclone公司;青霉素/鏈霉素溶液購自索萊寶公司;CB2受體激動劑JWH133和抑制劑AM630購自美國Tocris Bioscience公司，用DMSO溶解制成儲備溶液（1 mmol/L）置于-20 ℃儲存，使用時用培養液稀釋至工作濃度;兔源CB2受體抗體購自英國Abcam公司;兔源GAPDH抗體購自博奧森生物技術有限公司;HRP標記山羊抗兔IgG購自聯科生物技術有限公司;TRIzol購自南京諾唯贊生物科技有限公司;PCR逆轉錄試劑盒和SYBR Green購自abm公司;新生SD大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 細胞培養及分組

取新生24 h SD大鼠中腦，將其置于DEMED/F12基礎培養液中，除去腦膜和血管，用1 000、200、10 μL槍頭輕輕吹打使其呈渾濁離散狀態，收集至大離心管中。離心，棄上清，加入含體積分數0.10胎牛血清、20 g/L青霉素/鏈霉素的DEMED/F12培養液，吹打混勻后將細胞接種到培養瓶中，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中差速黏附處理（倒置放置）30 min，隔天更換新鮮培養液培養7 d以上，待細胞長滿瓶底90%以上時，置于37 ℃搖床中以210 r/min振蕩16～18 h除去其他膠質細胞，更換新鮮培養液，用胰酶消化法收集細胞，采用特定星形膠質細胞標記物（GFAP）的免疫熒光染色進行鑒定，星形膠質細胞純度≥95%，進行下一步實驗。將原代培養的星形膠質細胞分為Control組（A組）、MPP+組（B組）、JWH133+MPP+組（C組）和AM630+JWH133+MPP+組（D組）。 Control組正常培養;MPP+組加入200 μmol/L的MPP+孵育24 h;JWH133+MPP+組用1 μmol/L JWH133預處理40 min，然后加入200 μmol/L MPP+共孵育24 h;AM630+JWH133+MPP+組用1 μmol/L JWH133和1 μmol/L AM630預處理40 min，然后加入200 μmol/L MPP+共孵育24 h。

1.3 免疫印跡法（Western Blot）檢測CB2 受體蛋白的表達

Control組和MPP+組星形膠質細胞經處理后，吸凈培養板中的培養液，每孔加入100 μL的裂解液（RIPA裂解液∶PMSF=99∶1），冰上裂解30 min。刮下底部的蛋白置于相應的EP管中，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，取上清80 μL，用BCA法測定蛋白濃度。每組蛋白的上樣量為20 μg，電泳（電壓為80 V和120 V）后將蛋白轉移至PDVF膜上（轉膜電流為300 mA）。用50 g/L BSA封閉液封閉1 h，然后將PDVF膜放入CB2受體一抗溶液中，置4 ℃搖床上孵育過夜。次日用TBST清洗3次，每次10 min，將PDVF膜放入二抗中，室溫孵育1 h，重復TBST 清洗。使用ECL顯色液處理進行顯影。目的蛋白的表達以CB2受體與GAPDH灰度值的比值表示。實驗重復5次，取平均值。

1.4 實時熒光定量PCR（PT-PCR）檢測COX-2和iNOS mRNA水平

本文4組星形膠質細胞經處理后，采用TRIzol法提取總RNA，將每個樣品在1 000 μL TRIzol試劑中勻漿以純化總RNA，使用反轉錄試劑盒對2 μg的總RNA進行反轉錄：加入AccuRT反應混合物（4×）和DEPC水，使總體積達到8 μL，42 ℃變性2 min;加入12 μL的反應體系（內含AccuRT反應混合物終止液2 μL、多合一RT Master Mix（5×）4 μL、DEPC水6 μL） 25 ℃作用10 min，繼以42 ℃作用15 min逆轉錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量檢測COX-2和iNOS的基因表達[18]。大鼠原代星形膠質細胞RT-PCR擴增引物及其序列見表1。采用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。實驗重復5次，取均值。

1.5 統計學分析

應用Graphpad Prism 5.0軟件進行統計學分析，實驗所得數據以±s表示，兩組間比較采用F檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），然后用Turkey法進行組間兩兩比較，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 ?果

2.1 MPP+處理對原代星形膠質細胞CB2受體蛋白表達的影響

Control組和MPP+組CB2受體蛋白相對表達量分別為0.80±0.08和1.12±0.08，兩組比較差異有統計學意義（F=29.78，P<0.01）。表明MPP+處理可以上調原代星形膠質細胞CB2受體蛋白的表達，提示炎癥時星形膠質細胞CB2受體表達增多。見圖1。

2.2 JWH133對MPP+誘導的原代星形膠質細胞COX-2和iNOS基因表達的影響

與Control組相比，MPP+組COX-2和iNOS基因表達明顯上調（F=22.59、11.27，q=10.13、5.57，P<0.01）;JWH133+MPP+組細胞COX-2和iNOS基因表達水平較MPP+組均明顯降低，差異均具有統計學意義（q=6.26、4.16，P<0.05）;而JWH133的抗炎作用可被AM630阻斷，AM630+JWH133+MPP+組COX-2和iNOS基因表達水平較JWH133+MPP+組明顯升高，差異有統計學意義（q=5.34、5.67，P<0.01）。見表2。

3 討 ?論

大麻素系統包括內源性大麻素、大麻素受體以及內源性大麻素的合成酶和降解酶。大麻素受體包含大麻素Ⅰ型受體（CB1受體）和CB2受體[7]。大麻素受體與G蛋白耦聯，通過抑制腺苷酸環化酶和電壓門控鈣通道（例如N型、P/Q型和L型鈣電流）介導信號轉導[9]，激活有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和向內整流鉀離子通道[19]。與CB1受體調節相比，CB2受體的激活已經被證明沒有精神副作用[20]。近年來關于激活CB2受體對神經退行性疾病具有保護作用的研究日漸增多，尤其是針對它的抗炎作用，已有大量研究證據支持CB2受體可以通過參與抑制炎癥反應而起到神經保護作用[21-22]。GMEZ-GLVEZ等[23]發現，使用HU-308（一種CB2受體激動劑）激活CB2受體可以抑制脂多糖誘導的紋狀體和黑質中炎性因子（例如iNOS）的表達。CHUNG等[16]的研究表明，使用大麻素受體激動劑WIN55、212和JWH133激活CB2受體，可以調節1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的小膠質細胞活化和炎性因子的表達，從而防止PD小鼠模型中黑質紋狀體DA能神經元的死亡。TAO等[24]于2016年發現，JWH133激活CB2受體可以通過促進小膠質細胞表型從M1轉至M2，顯著抑制炎性因子的釋放[25]，從而對神經炎癥產生影響。JWH133是一種選擇性CB2受體激動劑，對CB2受體的選擇性是CB1受體的200倍，對CB2受體具有很高的親和力[11]。本課題組在前期工作中已顯示，JWH133激活CB2受體具有對抗MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡和神經毒性的作用。關于CB2受體起到的神經保護作用，人們更關注的是CB2受體在小膠質細胞中的抗炎作用，或者CB1/CB2受體在中樞神經系統中的協同工作[26]。但是最近有研究通過免疫組織化學實驗分析顯示，在PD病人腦中黑質區CB2受體與星形膠質細胞共定位，而不與其他神經膠質細胞或神經元共定位[27]。而且與正常對照組相比較，在PD病人中樞神經系統炎癥狀態下，星形膠質細胞CB2受體的表達急劇增加[28]。星形膠質細胞在PD進程中炎癥所導致的神經元功能障礙和死亡中起關鍵的作用[28-29]，活化的反應性星形膠質細胞釋放炎性因子（如IL-1β、TNF-α、COX-2和iNOS）以及活性氧的產生增加[30]，會加劇炎癥過程，促進PD的發生[7，31]。而抑制活化的星形膠質細胞釋放炎性因子將會對PD起到一定的改善作用。

MPP+是MPTP的有毒代謝產物，它可以激活神經膠質細胞、神經元和肥大細胞釋放神經炎性遞質[32]。本實驗應用MPP+制備原代星形膠質細胞炎癥模型。Western Blot檢測結果顯示，MPP+作用于原代星形膠質細胞可引起CB2受體蛋白表達的升高，表明炎癥時星形膠質細胞CB2受體表達增多。為了檢測CB2受體表達增多是否具有抗炎作用，本研究使用選擇性CB2受體激動劑JWH133來激活CB2受體，然后通過檢測炎性因子COX-2和iNOS的基因表達水平，探討JWH133對炎癥反應的作用。COX-2是生成前列腺素的關鍵酶，iNOS可催化生成NO，它們對神經元具有毒性作用，參與并誘導神經炎癥，導致神經元細胞死亡[33]。本實驗研究結果顯示，使用1 μmol/L的JWH133對原代星形膠質細胞進行預處理，能夠有效抑制MPP+誘導的COX-2和iNOS基因表達上調，表明選擇性激活CB2受體對原代星形膠質細胞具有明顯的抗炎作用。進一步使用1 μmol/L的AM630進行驗證，結果顯示其能夠阻斷JWH133的抗炎作用。

綜上所述，本實驗初步證明JWH133激活CB2受體能抑制MPP+誘導的原代星形膠質細胞的炎癥反應，抑制COX-2和iNOS基因的表達，其抗炎作用可以被AM630所阻斷。本文結果為通過激活CB2受體抑制星形膠質細胞神經炎癥從而治療PD提供了新的方案[34]，但還需要進一步研究其所涉及的機制。

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（本文編輯 馬偉平）