海洋酸化對顆石藻生理特性的影響*

黃書杰 徐 東 王東升 張現盛 葉乃好

海洋酸化對顆石藻生理特性的影響*

黃書杰1,2,3,4徐 東4王東升4張現盛4葉乃好4①

(1. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306; 2. 上海海洋大學 中國科學技術部海洋生物科學國際聯合研究中心 上海 201306; 3. 上海海洋大學 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室 上海 201306; 4. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071)

CO2濃度升高引起的海洋酸化對海洋生物尤其是鈣化生物顆石藻產生了很大的影響。然而，有關顆石藻對CO2濃度升高響應的研究多集中在單一的品系上，并且在種內或者種間產生了差異甚至相互矛盾的結果。本研究中，分別以赫氏顆石藻()和大洋球石藻() 2種顆石藻的鈣化和非鈣化的4個品系藻種為研究對象，設置了400、750、1000、2000 μatm共4個CO2濃度梯度，同時進行分批充氣培養，系統研究了海洋酸化對顆石藻的生長光合、氮源吸收、元素組成和鈣化效率等生理影響。結果顯示，隨著CO2濃度升高至2000 μatm，不同的顆石藻并未有一致的反應。除了非鈣化的(N-E)外，其他3個品系顆石藻的生長和顆粒有機碳產率都對CO2增加表現出積極的響應；隨著CO2濃度的升高，4種品系顆石藻的光合參數v/m、(Ⅱ)和葉綠素含量呈整體下降趨勢；CS369 (C-E)和(C-G)在第7天的鈣化效率分別下降了35.4%和68.9%；此外，4種品系顆石藻的顆粒有機氮產率都出現增加趨勢，而POC/PON和PIC/POC均呈現下降趨勢。本研究確定了海洋酸化對顆石藻的不同生理影響，這種差異影響可能會導致未來海洋生物多樣性的改變和其他生態系統進程的變化。

海洋酸化；顆石藻；特異性；生物多樣性

浮游植物在海洋食物網和生物地球化學循環中起著至關重要的作用(Falkowski, 2012)。顆石藻作為一種單細胞定鞭藻類，其細胞表面覆蓋著細胞內產生的方解石小板，是目前海洋中數量最多、分布最廣的鈣化浮游生物類群之一(Langer, 2009; Langer, 2013; Lohbeck, 2014; Young, 2014)。此外，顆石藻參與形成的碳酸鹽泵，在碳生物地球化學循環中發揮著重要作用；顆石藻能夠形成大規模的赤潮，這些特征被認為對全球氣候變化有反饋作用(Hutchins, 2011; Riebesell, 2011; Jin, 2013; Beaufort, 2014)。然而，大氣CO2濃度的增加引起的海洋酸化正在導致海洋表層pH值下降(預計到2100年和2300年分別減少0.5和0.7個單位)(Caldeira, 2003; IPCC, 2008; Ross, 2011)，同時改變碳酸鹽系統(Beaufort, 2010)。表層海水的這些變化對顆石藻和其他鈣化藻種產生了巨大的影響，預計將影響整個群落和生態系統，甚至破壞整個海洋環境(Turley, 2010; Hoppe, 2011; Sinutok, 2011; Lohbeck, 2012; Meier, 2014)。

過去十年間，許多有關實驗室培養和大型半封閉野外培養(中試實驗)的研究，都集中在單種顆石藻對海洋酸化的響應，這產生了不一致甚至相互矛盾的結果(Young,2014)。Riebesel等(2000)發現，隨著CO2濃度的增加，顆石藻的鈣化作用明顯減弱，同時伴隨著顆粒有機碳(POC)的增加。隨后對單一藻種赫氏顆石藻()的研究也表明，海洋酸化導致該物種的鈣化效率降低，但POC產量發生不均一(增加、減少或不受影響)變化(Zondervan,2002; Sciandra,2003; Delille,2005; Feng,2008; Müller,2010; Hoppe, 2011)。許多其他關于藻株應對海洋酸化的研究也顯示相互矛盾的結果，例如，顆石藻鈣化率的不斷增加(Iglesias-Rodriguez,2008; Shi,2009; Jones, 2013)或不敏感變化(Langer, 2009; De Bodt, 2010; Fiorini,2011b)。

此外，前人研究的3種鈣化顆石藻(,,)，都對CO2濃度升高表現出不同的響應模式。例如，CO2濃度升高使PC7/1的鈣化效率大幅下降44.7% (Riebesell, 2000)，4762藻株的鈣化率則表現出輕微增加(Rickaby,2010)，而AC370藻株反應不敏感(Fiorini, 2011b)。鑒于這種矛盾的結果，已經出現了一些同時測試不同顆石藻品系或種類的研究(Langer, 2006、2009; Fiorini, 2011b)。Langer等(2009)指出，先前海洋酸化研究中使用的不同赫氏顆石藻品系的敏感性在本質上是不同的，這可能是由于存在特異性反應的遺傳基礎所致。

過去有關海洋酸化對顆石藻鈣化作用影響的研究結果是不一致的，利用這些研究結果，在日益酸化的海洋環境中，準確預測未來顆石藻的命運仍然存在著問題。此外，基于短期實驗的海洋表層優勢種赫氏顆石藻對海洋酸化的響應也得到了深入的研究，文獻范圍也在迅速擴大。Langer等(2006)指出，單一品系顆石藻得到的實驗結果，可能會對很好適應當前CO2條件的不同顆石藻在應對未來可能發生的海洋酸化的響應研究產生偏差，而且實驗結果存在著缺乏普遍有效性的問題。此外，由于非鈣化的顆石藻藻種在海洋生態系統中發揮著重要的生態作用，非鈣化藻株的研究不應該被忽視，并且最近受到越來越多的關注(Kottmeier, 2014)。因此，當下需要同時研究更多不同的顆石藻品系，并研究CO2濃度升高對顆石藻的長期生物學效應。

本研究將CO2濃度從400 μatm升高到2000 μatm，來分別模擬當今和未來海洋酸化條件。同時，利用顆石藻的2個優勢種赫氏顆石藻和大洋球石藻，包括非鈣化的和鈣化的品系，進行一系列實驗。通過測定顆石藻的細胞密度、藻體光合參數、氮吸收速率、顆粒無機碳(PIC)產量、顆粒有機碳(POC)產量、顆粒有機氮(PON)以及它們之間的比率等生理參數，以分析不同品系顆石藻在不同CO2濃度下的潛在生理變化。此外，擬合了4個品系顆石藻相對于CO2變化的氮吸收速率響應曲線，并應用響應曲線中的動力學常數進一步分析4種品系顆石藻之間的本質響應差異。這些結果旨在了解類似條件下海洋酸化對不同顆石藻的差異影響，有助于評估未來環境條件下生物多樣性和其他生態進程的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和培養條件

實驗所用的鈣化和非鈣化的赫氏顆石藻(簡寫為N-E;CS369, 簡寫為C-E)以及鈣化和非鈣化的大洋球石藻(NIES-1318, 簡寫為N-G;, 簡寫為C-G)均來源于中國水產科學研究院黃海水產研究所微藻培養中心。藻細胞在天然過濾海水(0.22 μm)培養基中培養，海水中硝酸鹽和磷酸鹽的濃度分別為882 μmol/L和36.2 μmol/L，根據f/2培養基向海水中添加金屬和維生素(Guillard, 1962)。細胞培養在含1 L培養基的2 L三角燒瓶中，放置在植物培養箱中，培養溫度為20℃，鹽度為32。培養光源為白色熒光燈，光強為300 μmol/m2?s，光暗比為16 h/8 h，實驗采用處于指數生長期的顆石藻。

1.2 實驗內容及方法

1.2.1 實驗設置 采用與Xu等(2014)類似的方法，在植物培養箱(GXZ，瑞華，武漢)中，將空氣與CO2混合，向4種品系顆石藻泵入不同CO2分壓的空氣，設3個重復的1000 ml培養物進行培養。在準備階段，在上述條件下，4種品系顆石藻被分別培養到指數生長期。在培養基中用含有不同CO2分壓的空氣連續充氣，以提供400、750、1000和2000 μatm的CO2，各項初始值見表1。待持續充氣48 h穩定后，進行下一步實驗。每次實驗中，每個空氣–CO2混合物均設3份平行樣，以不添加細胞的實驗體系作為空白對照，分別監測細胞密度和pH值。在取樣點分別測定葉綠素含量、PIC、POC、DIC和堿度。

1.2.2 碳酸鹽體系分析 培養基pH值采用pH計檢測(Orion ROSS, Thermo Electron Corp., 美國)。總堿度(TA)用Whatman GF/F膜過濾，儲存在密封的100 ml三角燒瓶中，放置在-20℃，使用848自動滴定儀(Metrohm, Riverview, FL, 美國)獲得總堿度值。利用CO2SYS包獲得海水中碳酸鹽體系的pH、溫度、鹽度和TA，其中堿度根據Pelletier等(2007)提供的方法計算。

1.2.3 生長測定 在光學顯微鏡(Nikon，日本)下用血細胞計數器手動計數，獲得準確的細胞數以估算微藻的生長情況。利用如下公式測定比生長速率()：

=(ln1-ln0)/(1-0)

式中，0和1分別是初始時間0和隨后時間1的藻細胞濃度。

1.2.4 葉綠素熒光參數的測定及色素分析 使用Dual-PAM-100(Walz, Effeltrich, 德國)測定顆石藻的葉綠素熒光參數。測量前將樣品暗適應15 min，在弱光下測定初始熒光(0)。暗適應后的樣品在飽和脈沖光下獲得最大熒光值(m)。￠m代表被照亮后樣品的m產量，t是實時熒光產量。根據公式v/m=(m-0)/m計算最大PSⅡ量子產額(v/m)。有效PSⅡ量子產率計算：(Ⅱ)=(￠m-t)/￠m。

為了確定色素含量，樣品被過濾收集到GF/F過濾膜(25 mm)上，然后在4℃的黑暗條件下，用10 ml的90%丙酮提取24 h，7000 g離心10 min后，上清液用于室溫下色素含量分析。葉綠素含量采用Jeffrey等(1975)的方法測定。

1.2.5 氮吸收速率的測定 每個實驗體系收集5 ml水樣，迅速用醋酸纖維素膜過濾，置于聚乙烯離心管中，冷凍保存于-80℃。營養鹽分析前，將樣品解凍至室溫，用營養鹽自動分析儀(Bran and Luebbe AA3, 德國)對硝酸鹽濃度進行光度分析。氮吸收速率計算公式：NUR=(0-t)//，NUR為氮吸收速率(pmol of nitrate?N/cell?d)，0和t分別為實驗開始和第7天硝酸鹽濃度(pmol/L)；為水的體積(L)；為細胞數；為時間間隔(d)。此外，使用米氏方程曲線(Michaelis, 1913; Hutchins, 2013)擬合每個CO2濃度下的平行樣品關于氮吸收的CO2響應曲線。使用Origin Pro軟件進行動力學常數和曲線相關系數的計算。

1.2.6 藻體中碳和氮元素的含量分析 將樣品過濾到灼燒過(500℃, 5 h)的GF/F膜(25 mm)，保存在-20℃直到分析。在分析之前，顆粒有機碳的濾膜用濃鹽酸熏24 h，除去無機碳，再次干燥。然后將過濾膜裝好進行后續分析。POC、PON、TPC濃度由Vario ELⅢ自動元素分析儀(Elemntar Analysensysteme Co., 德國)依次測定。通過TPC與POC的差異，計算PIC濃度，POC、PIC或PON產量計算公式如下：

=比生長速率(d?1)×細胞中POC、PIC或PON含量(pg/cell)。

1.2.7 數據分析 實驗數據的統計分析采用SPSS 17.0軟件，運用單因素方差分析(One-way ANOVA)來分析各處理之間差異的顯著性，以<0.05作為差異顯著水平。

2 結果

2.1 實驗中碳酸鹽體系的變化

本實驗采用充氣法模擬海水酸化，檢測不同處理條件下的海水碳酸鹽系統參數的變化，包括pH、DIC、HCO3?、CO32?和CO2。圖1和表1為不同顆石藻的海水pH值隨CO2濃度的變化情況。濃度為400、750、1000和2000 μatm的CO2對應的pH值分別為8.06±0.02、7.79±0.01、7.65±0.02和7.48±0.02。因為海水中含有引起堿度變化的緩沖液，本研究設定的實驗條件與預期的海洋酸化條件并不完全相同。有些實驗測量需要大量的生物量，因此，需要較大的細胞密度，從而導致碳酸鹽體系的變化。盡管存在這些變化，但在整個實驗過程中，培養藻的4種梯度的pH值始終保持著明顯的差異，使研究結果具有重要意義。

2.2 海洋酸化對顆石藻生長的影響

實驗室條件下，不同CO2分壓對4種品系顆石藻生長的影響如圖2所示。所有處理的藻細胞濃度隨著培養時間的延長逐漸升高并達到最大值，隨后，藻細胞濃度逐漸下降直至實驗結束。CO2分壓對每種顆石藻的細胞濃度均有顯著影響。隨著CO2濃度逐漸增加，C-E、N-E和N-G均顯示出積極響應，然而對于N-E，CO2分壓達到2000 μatm時，N-E的生長被抑制。所有處理的藻細胞在前7 d均呈指數級生長，其特定生長速率如圖2e~h所示。CO2濃度持續增加至2000 μatm，比生長速率分別增大約53% (C-E)，36% (N-G)和30% (C-G)。然而，對于N-E，當CO2濃度達到1000 μatm，比生長率增加約26%。當CO2連續升至2000 μatm時，與對照組相比，海洋酸化導致N-E的比生長率下降14%。

表1 初始碳酸鹽系統參數

Tab.1 The data of the original carbonated system

圖1 4種品系顆石藻在不同的CO2濃度下隨著培養時間改變的海水pH值變化

[N-E:(a); C-E:CS369 (b); N-G:NIES-1318 (c); C-G:(d)]

2.3 海洋酸化對顆石藻光合特性的影響

圖3為海洋酸化對顆石藻v/m和Y(Ⅱ)在內的光系統參數變化的影響。當CO2升高至2000 μatm時，所有處理的v/m和Y(Ⅱ)均顯示出負面影響，但響應幅度在4種品系顆石藻中不同。隨著培養時間的延長，除了CO2濃度達到2000 μatm時，C-E的參數v/m在第10天達到最大值，N-E一直下降之外，4種品系顆石藻的光合系統參數在第7天達到最大值，隨后下降直至實驗結束。隨著CO2分壓增加到2000 μatm，對于N-E、C-E、N-G和C-G，海洋酸化對v/m的顯著抑制作用分別發生在第7、4、13和10天，而對Y(Ⅱ)的抑制作用分別發生在第4、13、13和10天。實驗結束后，與對照組相比，當CO2分壓升高至2000 μatm，v/m被抑制，分別下降60%、45%、55%和46%；Y(Ⅱ)也被抑制，分別下降75%、69%、76%和39%。此外，與N-E和N-G的最大Y(Ⅱ)值相比[低于400 μatm時分別為(0.32±1.90)%和(0.34±2.60)%]，C-E和C-G的最大Y(Ⅱ)值[低于400 μatm時分別為(0.39±3.10)%和(0.48±2.30)%]顯著較高，而v/m無顯著差異。

圖2 不同CO2濃度下4種品系顆石藻的生長曲線(a~d)和比生長速率(e~h)

圖3 培養過程CO2濃度升高對4種品系顆石藻的光合參數Fv/Fm (a~d)和Y(Ⅱ)(e~f)的影響

當CO2濃度從400 μatm升高至2000 μatm對不同品系顆石藻細胞內葉綠素含量的影響見圖4。細胞葉綠素含量在第20天(N-E、C-E和N-G)和第7天(C-G)達到最大值，在初始值出現微小變化后，葉綠素含量逐漸下降，直至實驗結束(圖4a~d)。然而，隨著時間的推移，葉綠素呈現出整體穩定下降的趨勢(圖4e~f)。然而，隨著CO2濃度從400 μatm增加至1000 μatm，每種顆石藻葉綠素含量以同樣模式下降(除了個別點以不同的方式呈現)。然而，當CO2濃度達到2000 μatm時，測定的結果表現出不同的反應。與1000 μatm相比，當CO2濃度為2000 μatm時，在每個采樣點，隨著培養時間的延長，N-E的葉綠素和的含量降低。然而，對于藻株C-E、N-G和C-G，隨著CO2濃度增加到1000 μatm，在每個采樣點葉綠素含量趨向于增加。

2.4 海洋酸化對顆石藻氮吸收速率的影響

海洋酸化對4種品系顆石藻氮吸收速率的影響如圖5所示。隨著CO2從400 μatm升高至2000 μatm，4種品系顆石藻的氮吸收速率均增加，分別增加了48.2%(N-E)、33.9%(C-E)、41.6%(N-G)和34.3%(C-G)。氮吸收速率的最大變異值(48.2%, N-E)比最小變異值(33.9%, C-E)增大了近1.5倍。此外，4種品系顆石藻的氮吸收速率相對于CO2增加的響應根據米氏方程曲線擬合，由響應曲線得到2個半飽和常數(m, μatm CO2)和最大CO2飽和率(max, pmol N/cell?d)得到。藻體N-E中，最大m和max值分別是307.2 μatm和24.1 pmol N/cell?d，分別大于C-E最低值約1.7倍和1.3倍。

a:; b:CS369; c:NIES-1318; d:

2.5 海洋酸化對顆石藻元素組成及鈣化速率的影響

圖6為CO2升高對第7天的4種品系顆石藻的POC和PON的產生情況。當CO2達到2000 μatm時，顯著刺激顆石藻產生POC和PON(除了N-E)。N-E顆石藻有機碳生產率的變化是巨大的，在1000 μatm CO2濃度條件下，表現出明顯的增加，但在2000 μatm時，表現出大幅下降。與對照組相比，C-E、N-G和C-G藻種的POC產量分別增長約101%、35%和49%，其中C-E品系POC產率變化分別為N-G、C-G品種的2.9倍、2.1倍。此外，在此范圍內，PON較對照組分別增加233%(N-E)、289%(C-E)、148%(N-G)和129%(C-G)，增幅較大。然而，隨著CO2由400 μatm升高至2000 μatm，4個藻種的顆粒有機碳和氮的變化導致顆粒有機碳與顆粒有機氮的比值(POC/PON)分別減少76.6%(N-E)、48.3%(C-E)、45.7%(N-G)和34.9%(C-G)。此外，與400 μatm CO2相比，2000 μatm CO2對顆粒有機碳的產率有負面的影響，2個鈣化品系C-E和C-G的鈣化率呈現更大程度的降低，分別為35.4%和68.9%。當CO2濃度增大到2000 μatm，C-G比C-E呈現更高的PIC還原力。同時，這2種藻的PIC/POC值也分別下降67.9%和79.2%。

圖6 海水酸化對4種品系顆石藻顆粒有機碳和顆粒無機碳的生產率及碳氮比的影響

3 討論

本研究首次在實驗中使用了非鈣化品系和鈣化品系的2種顆石藻，研究了它們對CO2升高的響應。同時，利用氮吸收率擬合的CO2響應曲線，獲得的動力常數來分析不同顆石藻的遺傳變異性。當CO2濃度升高到2000 μatm時，與其他3個藻種不同程度的積極響應相比，N-E被嚴重抑制。本結果表明，海洋酸化對顆石藻產生生理影響，不同顆石藻對海洋酸化具有特異響應，最近的研究表明，不同的浮游植物對CO2濃度升高的響應存在種間異質性(馬莎等, 2019)，這與本研究結果類似。作者推測，海洋酸化可能導致未來海洋生物多樣性、營養相互作用關系和其他生態系統進程的變化。

3.1 海洋酸化對不同顆石藻生長和光合系統參數的影響

研究表明，與對照組相比，除了N-E，高CO2濃度(增加到2000 μatm)促進藻細胞的生長(圖2)。而N-E的生長在CO2濃度為2000 μatm時下降，其特定生長率在第7天顯著降低了7.61%。然而，在CO2濃度升高至1000 μatm之前，N-E的生長保持增長狀態(圖2a和2e)。Fiorini等(2011b)也得到了類似的結果，富含CO2(750 μatm)的水中，顆石藻藻狀細胞的生長呈現增長趨勢。

前人的研究表明，由于細胞外碳酸酐酶的活性較低，導致其CO2濃縮機制(CCM)效率相對較低(Herfort, 2002; Trimborn, 2007; Rokitta, 2012a; Jin, 2013)，所以，目前海洋中的顆石藻具有碳限制性。因此，酸化的海水可利用CO2含量的增加可能會加速Rubisco附近CO2的積累，以彌補碳供應不足，進一步促進顆石藻的羧化作用和生長作用(伴隨著POC的增加) (Barcelose, 2010; Reinfelder, 2011; Jin, 2013; Kottmeier, 2014)。本研究中，觀察到4種品系顆石藻在高CO2條件下的生長情況，N-E在1000 μatm增長23%，另外3種藻在2000 μatm時分別增長53%(C-E)、36%(N-G)和30%(C-G)(圖2)。然而，每個品系對CO2升高的反應能力和策略不同。此外，對于N-E來說，在2000 μatm條件下，幾乎處于白化狀態。

研究表明，細胞外pH值的變化可以通過破壞恒定膜電位平衡和生理參數來影響藻細胞的活性(Langer, 2006; Taylor, 2011; Rokitta, 2012b)。相比于其他3種品系顆石藻，由于pH值下降及超過耐受能力(7.48, 2000 μatm)，N-E更加敏感而呈負反應。因為顆石藻是一種豐富的藻種，具有獨特的生理和形態特征(Winter, 1994; Raven, 2012)，推測顆石藻對CO2增加的特異性反應具有遺傳基礎。Read等(2013)報道了第一次解析的基因組(來自CCMP1516)在復合種內的變異性支持了顆石藻在不同生境中的繁榮發展。結合本實驗結果，猜想顆石藻固有的遺傳特異性可能導致其對海洋酸化產生特異性反應。

然而，由于光合系統參數和色素含量分析的藻類光合作用(與生長緊密相關)能力隨著CO2增加產生多種負反應，尤其N-E幾乎喪失光合能力(圖3和4)。這些涉及到光系統活動的結果表明，由于pH值下降(CO2升高)對細胞離子平衡的影響，藻細胞仍然處于光合不健康狀態(Langer, 2006)，誘導了葉綠素含量降低(圖4)。特別是當CO2濃度達到2000 μatm，超過可調節的范圍，與其他3種品系顆石藻相比，NE的V/m和葉綠素的含量被嚴重影響(圖3a和4a)。與CO2升高對生長的不同反應相類似，不同藻類光合作用對CO2升高響應也具有特異性。對于整個生態系統來說，一部分的微小變化可能會影響整個生態系統，顆石藻對海洋酸化的特異反應可能會影響生物多樣性和其他生態過程(Orr, 2005; Hendriks, 2010)。

3.2 海洋酸化對顆石藻氮吸收速率的影響

考慮到海洋酸化對營養鹽吸收的影響，本研究在第7天取樣測試了不同CO2水平下各品系藻株的氮吸收速率，并擬合了每種顆石藻應對CO2變化的氮吸收速率響應曲線，以供進一步分析。結果表明，當CO2濃度升高至2000 μatm時，所有品系的氮吸收速率增加(圖5)。非鈣化藻株N-E和N-G的氮吸收速率顯著的增加了41.6%和48.2%(圖5a和c)，而鈣化藻株C-E和C-G分別在氮吸收速率提高了33.9%和34.3%。Jin等(2013)的研究表明，CO2增加導致顆石藻對無機氮的吸收增強，硅藻硝酸鹽還原酶基因上調。此外，各品系藻種之間也存在差異。

先前的研究表明，在海洋酸化條件下，顆石藻細胞具有能量再分配的過程(Raven, 2011; Beaufort, 2011)，導致額外的ATP釋放優先支持額外的氮吸收以合成更多的蛋白質(Jin, 2013)。然而，與非鈣化細胞相比，鈣化細胞需要更多的能量來轉運鈣化作用中的氫離子到酸性環境中(Suffrian, 2011; Taylor, 2011; Beaufort, 2011; Stojkovic, 2013)。CO2升高到2000 μatm時，鈣化品系藻株的氮吸收速率顯著低于非鈣化藻株。此外，本研究在CO2升高下測定PON產量也間接證實了氮吸收的能量再分配偏好(圖6b)。

藻氮吸收速率相對CO2變化的響應曲線，證實了CO2對這些顆石藻的影響行為。由響應曲線推導出的動力學常數(m)表示酶對底物的親和力，m值越大，親和力越小(Michaelis, 1913)。最近，Hutchins等(2013)通過分析不同的動力學常數，證實了固氮作用與CO2濃度之間的品系特異性差異。在這項研究中，相比其他3種藻株，N-E顯示出最高m值，即NO3還原酶的親和力最低(圖5)。這一結果與其他測量參數，如生長速率、光合活動等反映出相同的趨勢，這表明CO2濃度升高嚴重抑制了N-E的生命活動。

3.3 海洋酸化對不同顆石藻元素組成的影響

浮游植物的化學元素組成會對營養相互作用關系有一定影響，并最終對海洋營養元素的生物地球化學產生影響，因為海洋浮游動物的膳食價值隨POC與PON的比值(C∶N)變化而變化(Hutchins, 2009; Anderson, 2013)。本研究測量了不同品系顆石藻的C∶N比例，以評估生物有機體的元素組成是否受到CO2濃度的影響，并探討了影響的程度。結果顯示，在2000 μatm CO2濃度下，4種品系顆石藻的元素組成均發生變化，C∶N分別降低76%(N-E)、48%(C-E)、45%(N-G)和35%(C-G)(圖6)。N-E相對其他3種顆石藻的影響較大，C-G的影響最小。在之前的研究中，Fiorini等(2011a)和Rickaby等(2010)的研究表明，當CO2濃度增強時，顆石藻發生了相似的變化。當CO2濃度從400 μatm持續上升到2000 μatm時，POC(除了在2000 μatm下的N-E)和PON的產率增加(圖6)。

研究還發現，與對照組相比，PON的增加量比POC要高。前面已經討論過，由于CO2的升高，能量的重新分配導致了更多的氮吸收，增加了PON產量。盡管不同顆石藻的品系之間存在差異，這種偏好優勢使得PON產量超過POC產量，導致C∶N下降的幅度不同(圖6)。與Riebesell等(2011)之前的研究結果類似，C∶N比值隨著CO2濃度的變化具有高度的物種特異性。此外，這種變異比例可能是不同品系藻株間遺傳差異的體現。此外，也存在與目前的研究結果相反的結果，隨著CO2濃度的升高，細胞C∶N比值增加(Feng, 2010; Kottmeier, 2014)。

產生矛盾結果的原因可能是實驗設置的不同，如溫度、光照強度、藻種的選擇等。此外，最終結果表現出一種非常有趣的現象，非鈣化藻的C∶N比值比鈣化藻高。這種現象的原因尚不清楚，但很可能與顆石藻鈣化作用有關。這些結果表明，CO2濃度的增加影響了顆石藻C∶N比值，并且對不同顆石藻產生了不同的影響。此外，它還將進一步影響浮游植物的捕食選擇壓力，并對許多生物地球化學循環過程產生影響(特別是碳輸出通量)(Iglesias-Rodriguez, 2008)。

3.4 海洋酸化對顆石藻鈣化效率的影響

在過去幾年里，顆石藻PIC生產效率(鈣化率)已被廣泛用于顆石藻的研究，以預測海洋酸化的生物學影響。結果表明，當藻細胞生長在高于當前CO2水平時(400 μatm)，主要反應是鈣化率下降或者至少減少PIC/POC的值(Zon-dervan, 2001; Langer, 2006; Muller, 2010; Hoppe, 2011)。本研究中，關于PIC的響應與上述的趨勢是一致的。同時，當CO2濃度由400 μatm升高到2000 μatm時，鈣化赫氏顆石藻和鈣化大洋球藻在第7天的鈣化率分別下降35.4%和68.9%(圖7)。相比大洋球藻，赫氏顆石藻更容易受海洋酸化的影響，從而導致生態不平衡的因素。但對于實驗中所用的非鈣化種，由于失去了表面覆蓋的鈣化外殼，PIC的產量幾乎可以忽略不計。

最近各種生物體的研究顯示，鈣化很大程度上是由飽和碳酸鈣而不是單靠pH值控制(Langer, 2006; Trimborn, 2007)。海水中的飽和碳酸鈣由(DIC)和pH值共同控制(Iglesias-Rodriguez, 2008)。當表層海水過飽和碳酸鈣由于海洋酸化或其他自然過程條件下飽和程度下降時，分布在貝殼和骨骼中的碳酸鹽礦物開始溶解(Feely, 2009)。該研究表明，當CO2濃度由400 μatm升高到2000 μatm，鈣離子的飽和度降低，但依然處于溶解發生的閾值。結果明確表明，與對照組相比，PIC的產量(鈣化效率)最終有所下降(圖7)。

Langer等(2009)的研究結果也出現同樣的現象，雖然鈣離子的飽和度大于1，但顆粒無機碳的溶解仍然發生。為了解釋這一現象，我們發現400 μatm和2000 μatm CO2在第7天的pH值介于8.81~7.62之間(表1和圖1)，并且與空白對照相比，細胞的生理狀態和pH值有一定的變化。這些變化影響了藻細胞的光合作用，這意味著顆石藻細胞不完全適應改變后的pH條件。Bach等(2011)認為，鈣化作用對pH值降低具有特異性反應。在CO2升高的情況下，顆石藻的鈣化作用是一個嚴格控制的生物進程(Mackinder, 2010)，將受到pH水平下降的影響。

最近，大量的生理和分子研究證據表明，當使用HCO3–進行鈣化作用(產生H+，并保持細胞pH穩態接近中性)時，H+必須通過膜離子通道被清除(Suffrian, 2011; Taylor, 2011)或者在顆石藻細胞中被總和(Fabry, 2008; Rokitta, 2012; Stojkovic, 2013)。為了維持合適的跨質膜電位差和H+射流，H+輸運過程中需要能量(Raven, 2011)。當CO2升高導致水體pH值和/或[CO32-]水平降低時，單位鈣化輸入的能量可能更大，從而導致鈣化率降低(Raven, 2011; Beaufort, 2011)。通過研究CO2增加對顆石藻鈣化的不利影響，顆石藻的鈣化作用與生物地球化學循環密切相關，雖然我們對鈣化作用的降低給出了合理的解釋，但這種解釋只是事實的一小部分。目前，海洋酸化對鈣化顆石藻影響的原因仍然需要進一步的探索。

圖7 海水酸化第7天對鈣化顆石藻的顆粒無機碳生產率以及顆粒無機碳與顆粒有機碳的比值的影響

本研究表明，不同顆石藻在應對海洋酸化威脅時表現出了特異的生理響應，隨著CO2濃度的逐漸增加，不同顆石藻在維持穩定的原始狀態都發生了不同程度的改變。因此，物種分布和豐度的潛在變化可以通過海洋食物網的多種營養水平傳遞。雖然海洋酸化對生態系統長期影響的研究還處于起步階段，但這些結果可能指示出在海洋酸化條件下生物多樣性、營養相互作用關系、生物地球化學循環和其他生態系統進程的變化。

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Effects of Ocean Acidification on Physiological Characteristics of Coccolithophores

HUANG Shujie1,2,3,4, XU Dong4, WANG Dongsheng4, ZHANG Xiansheng4, YE Naihao4①

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306; 4. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071)

Ocean acidification caused by increasing amounts of carbon dioxide has a great impact on marine organisms, especially calcified coccolithophores. However, culture experiments examining the response of coccolithophores to elevated CO2pa have mostly been based on investigations of a single strain and have yielded differences and even contradictory results from experiments between and even within species. Here, four strains of the coccolithophores, which contained naked and calcifying strains, were investigated simultaneously for the first time. Four carbon dioxide concentration gradients (400 μatm, 750 μatm, 1000 μatm, and 2000 μatm) were set up to systematically study the effects of ocean acidification on growth, photosynthesis, nitrogen source absorption, element composition and calcification efficiency of four coccolithophore species by batch aeration culture. The results did not show a uniform response from the different strains to elevated CO2concentrations up to 2000 μatm, and the naked strain(N-E) was seriously suppressed, which was in sharp contrast to the positive response of the other three algae to the different levels. On the other hand, photosynthetic parametersv/m, Y(II) and pigment show overall downward trend for all four strains, and calcification efficiency of C-E and C-G decrease 35.4% and 68.9% respectively, on the seventh day. In addition, the four coccolithophore strains of particulate organic nitrogen production show an increasing trend and the resulting POC/PON and PIC/POC declin. We determined that the responses of coccolithophores to ocean acidification are specific, and this variation may cause changes to biodiversity and other ecosystem processes in the ocean of the future.

Ocean acidification; Coccolithophores; Specific; Biodiversity

YE Naihao, E-mail: yenh@ysfri.ac.cn

* 國家重點研發計劃“藍色糧倉科技創新”重點專項(2018YFD0900703; 2018YFD0901503-8)、中國水產科學研究院黃海水產研究所基本科研業務費(20603022019006)、青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室漁業科技青年人才計劃項目(2018-MFS-T01)和山東省自然科學基金(ZR2017MD025)共同資助 [This work was supported by the National Key R&D Program of China (2018YFD0900703, 2018YFD0901503-8), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022019006), and Youth Talent Program Supported by Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (2018-MFS-T01), and Shandong Provincial Natural Science Foundation,?China (ZR2017MD025)]. 黃書杰，E-mail: huangshujie1221@163.com

葉乃好，研究員，E-mail: yenh@ysfri.ac.cn

2019-03-19,

2019-04-11

S917

A

2095-9869(2020)03-0011-14

10.19663/j.issn2095-9869.20190319003

http://www.yykxjz.cn/

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(編輯 馮小花)