懷山藥皮對淇河鯽血清生化、免疫指標及組織結構的影響

胡文攀，吳勝奎，李 衡，曹 慧，孟曉林,2，聶國興,2

(1.河南師范大學水產學院，河南新鄉 453007；2.河南省水產動物工程技術研究中心，河南新鄉 453007)

隨著科技的進步，集約化養殖程度不斷提高，高密度養殖在提升經濟效益的同時，也引發了魚類疾病頻發、抗生素濫用等諸多問題[1]，這給水產業健康發展帶來了巨大影響。雖然抗生素在預防和治療水生動物疾病方面效果顯著[2]，但長期或過量使用會破壞魚類機體免疫力，增強病原菌的耐藥性，增加魚體藥物殘留[3]。中草藥含有多種營養素、微量元素和生物活性物質，具有增強免疫力、促進生長、抑菌殺菌、保肝利膽等作用，在魚類集約化養殖中，已作為新型飼料添加劑替代抗生素廣泛使用[4]。

“懷山藥”，原產地河南焦作，有“懷參”的美譽，不僅是可食佳肴，也是地道藥材。目前，懷山藥有效成分的提取工藝以及功能性研究較為廣泛[5,6]，但關于山藥皮的應用研究尚少，主要集中在成分提取[7，8]，以及食品加工方面[9]。在山藥加工過程中山藥皮被作為廢料丟棄，不但污染環境，而且也是對資源的極大浪費[8]。研究發現，懷山藥皮含有薯蕷皂苷、多糖、黃酮、多酚等多種活性成分[10]，其藥用價值與山藥籽實相當。因此，如何有效利用山藥皮，將其進行二次開發利用具有十分重要的意義。

淇河鯽(Carassiusauratus)屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯽屬(Carassius)，是河南省特有的珍稀優質魚類[11]。因肉質鮮美營養價值豐富，深受消費者的喜愛[12]。本研究通過在飼料中添加不同劑量的懷山藥皮，研究其對淇河鯽血液生化指標、肝腸組織形態、免疫相關基因表達的影響，旨在為懷山藥皮在水產上的開發利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗用添加劑懷山藥皮，產自河南省武陟縣，山藥皮經超微粉碎過60目篩，60 ℃烘干。將懷山藥皮分別按基礎飼料0.5%、1%和2%的添加量，制成實驗飼料。飼料原材料粉碎過篩(60目)，按配方比重拌勻，加油、加水充分混合。混合方法采用多次混合、逐級擴大的方法。用飼料顆粒機(KL-125B)制成粒徑2.5 mm的顆粒飼料，晾干后于-20 °C保存備用。基礎飼料配方見表1。

1.2 實驗設計及飼養管理

實驗魚購自新鄉市延津漁場，購回后用20 mg /L的高錳酸鉀水溶液藥浴10 min，于河南師范大學水產養殖基地循環水系統暫養2周，以基礎飼料飽食投喂。正式實驗選取健康狀況良好的體質量(106.76±3.74)g的淇河鯽240尾。實驗分為4組,分別為對照組(NC)、0.5%添加組(LYP)、1%添加組(MYP)和2%添加組(HYP)。每組設3個重復，每個重復20尾魚，實驗養殖8周。按體重3%的量每天投喂4次，分別于每日8 ∶30、11 ∶30、14 ∶30、17 ∶30進行。每日記錄攝食情況和死亡數量，每兩周進行飼喂量的調整。投喂期間定期檢測水質，保證溶解氧高于6 mg/L，氨基氮小于0.01 mg/L。水溫控制在(25±1)℃，光照周期為12L ∶12D。

表1 基礎飼料組成及營養成分Tab.1 Composition and nutrient composition of base feed

注：1)每kg維生素預混料含：VA 800 000 IU，VB1 1 500 mg，VB21 250 mg，VC 2.5 g，VD3160 000 IU，VE 15 g，VB124 mg，VK3325 mg，VB61 100 mg，肌酸5.5 g，葉酸70 mg，生物素125 mg，煙酸4 g，泛酸4.5 g。2)每千克礦物質預混料含：P 105 g，Ca 330 g，Mg 45 g，Fe 15 g，I 50 mg，Se 9 mg，Cu 0.35 g，Zn 3 g，Mn 1.5 g，Co 11 mg。

1.3 樣品采集

養殖實驗結束后，將淇河鯽禁食24 h，對每桶實驗魚分別計數和稱重。取樣前用10 mg/L MS-222溶液對魚進行麻醉，每個桶中隨機選取10尾魚放在冰盤上解剖，摘取內臟，沖洗干凈，截取每條魚的中腸和肝臟，用PBS沖洗，使用10%福爾馬林溶液對組織進行固定。另10條魚進行尾靜脈采血，室溫放置2 h后，3 000 r/min的轉速，4 ℃離心l5 min，取上清-20 ℃保存；采血后取黃豆粒大小肝臟，1 cm左右中腸，液氮迅速冷凍，放置-80 ℃冰箱保存，用于組織RNA的提取。

1.4 指標測定

1.4.1 生長指標測定

計算肝體比(HIS，%)、臟體比(VSI，%)、特定生長率(SGR，%/d)、增重率(WGR，%)、飼料系數(FCR)、存活率(SR，%)、初始平均體重(IBW)和末平均體重(FBW)。

WGR=(Wt-W0)/W0×100%，

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%，

FCR=WF/(Wt-W0)，

VSI=WV/W×100%，

HIS=WH/W×100%，

式中：Wt為第t天末均重，W0為第0天初始均重，t為實驗天數，WF為飼料消耗總量，WV為內臟重量，W為體重，WH為肝胰臟重量。

1.4.2 血清生化指標的測定

采用全自動生化分析儀(AU-5800，BECKMAN)檢測血清中谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)的含量。

1.4.3 肝臟、中腸組織病理學觀察

采用H.E染色的方法[13]對淇河鯽肝臟及中腸進行組織病理學觀察。在對腸道形態進行觀察時，選取了中腸肌層厚度和腸絨毛高度作為參考指標。同批次樣品連續切片，選取完整的片子進行觀察統計，然后取平均值作為每個重復實驗魚腸絨毛高度、肌層厚度的測定數據。

1.4.4 免疫相關基因的表達

基于淇河鯽免疫相關基因cDNA序列，設計正反向引物(見表2)，并以18S rRNA為內參基因。取1 μg總RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑說明書進行反轉錄。采用羅氏LightCycle 96?熒光定量PCR儀，參照SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNase Plus)(TaKaRa，大連)說明書進行qRT-PCR擴增。反應體系10 μL：5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大連)，0.3 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L)，0.3 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，1.0 μL cDNA模板，3.4 μL無菌水。擴增程序采用兩步法：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環，每個樣品3個平行，2-ΔΔCt法計算淇河鯽實驗樣本中免疫相關基因的相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR引物Tab.2 Quantitative real-time PCR primers

1.5 數據處理

實驗數據均用“平均值±標準差”表示，用SPSS 19.0軟件對數據進行One-Way ANOVA單因素方差分析和Duncan’s多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 山藥皮對淇河鯽生長性能的影響

由表3可以看出，與NC組相比，添加山藥皮的實驗組特定生長率、增重率有升高的趨勢，特定生長率分別提高了9.09%、18.18%、4.54%，增重率分別提高了21.96%、27.49%、17.17%，但差異不顯著；同時飼料系數與NC組相比有下降趨勢,分別為3.37%、0.67%、2.03%，但差異不顯著。LYP、MYP和HYP組肝體比、臟體比與NC組相比，無顯著差異，但LYP組與MYP組臟體比組間差異顯著。

表3 各組淇河鯽的生長指標Tab.3 Growth performance in the C.auratus fed the different diets

2.2 山藥皮對淇河鯽血清生化指標的影響

由表4可以看出，與NC組相比，各實驗組總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量均有升高趨勢，但無顯著性差異；與NC組相比，谷草轉氨酶活性在MYP組顯著性降低，堿性磷酸酶活性在MYP組顯著性升高；谷丙轉氨酶活性在各組間差異不顯著。

表4 各組淇河鯽的血清生化指標Tab.4 The values of the blood chemophysiological parameters in the C.auratus in different treatments

注：表中同行數據后標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 山藥皮對淇河鯽肝臟組織結構的影響

由圖1發現，LYP組與NC組相比，細胞膜與核膜更為完整且核染色質密度升高，同時空泡變性減輕，但效果不明顯。MYP組和HYP組肝細胞大小正常且細胞間界限相對較清晰，細胞膜核膜較整齊。

圖1 各組淇河鯽肝臟的組織切片(×400)Fig.1 Histological sections of liver of C.auratus in different treatments(×400)NM：細胞核偏移；VD：空泡變性

2.4 山藥皮對淇河鯽中腸組織結構的影響

由圖2觀察發現，MYP和HYP組相較于NC組，腸絨毛結構相對較完整，細胞清晰，絨毛高度和肌層厚度得到提高。通過對切片進行拍照測量得到中腸絨毛高度與肌層厚度的具體數值(表5)。可看出，與NC組相比，各組鯽中腸絨毛高度與肌層厚度有增高趨勢但不顯著。

圖2 各組淇河鯽中腸組織的切片(×100)Fig.2 Histological sections of mid-gut of C.auratus in different treatmentsV：腸絨毛；M：肌層

表5 各組淇河鯽中腸絨毛高度和肌層厚度Tab.5 The villous height and muscular thickness of mid-gut of C.auratus among different treatmentsμm

2.5 山藥皮對淇河鯽肝臟免疫相關基因的影響

各實驗組肝臟免疫相關基因表達情況如圖3所示。可以看出，在淇河鯽肝臟中，與NC組相比，抑炎基因IL-10的表達在HYP組顯著上調。CAT、GST的表達量，隨添加濃度的升高而升高，與NC組相比，CAT在HYP組具有顯著性，GST在MYP和HYP組表達量顯著升高。通路相關因子NF-κB與NC組相比表達量下降，在MYP組顯著性降低，TLR4在HYP組顯著性升高。

圖3 各組淇河鯽肝臟免疫相關基因mRNA相對表達量Fig.3 The relative mRNA expression levels of immune-related genes in C.auratus liver in each group“*”代表與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，圖4同。

2.6 山藥皮對淇河鯽中腸免疫相關基因的影響

各實驗組中腸免疫相關基因表達情況如圖4所示。可以看出，在淇河鯽中腸，與NC組相比，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達量有下降趨勢，抑炎基因IL-10的表達量在MYP和HYP組顯著上調。對于IL-10，MYP和HYP組表達量分別是NC組的4.5倍、4倍，與其他調控因子相比，實驗各組的上調幅度較大。CAT在HYP組顯著升高，Claudin-1在LYP和MYP組顯著性升高。與NC組相比，TLR4表達水平在MHY組顯著升高。

圖4 各組淇河鯽中腸免疫相關基因mRNA相對表達量Fig.4 The relative mRNA expression levels of immune-related genes in C.auratus mid-gut in each group

3 討論

3.1 山藥皮對淇河鯽生長指標的影響

山藥皮中富含皂甙、黃酮等多種生物活性物質，對機體生長、代謝及免疫力提升均有積極作用。以不同濃度的山藥皮粉飼喂肉仔雞，結果發現不同濃度的添加劑均對其生長無顯著性差異[14]。Ekenyem等[15]同樣在肉仔雞中以15%的山藥皮粉替代玉米粉，其增重率卻顯著高于對照及其它劑量組。在水產動物研究中，Lawal等[16]以不同濃度山藥皮粉替代玉米粉飼喂革胡子鯰，結論表明山藥皮粉對其增重率、飼料轉化率及特定生長率均無影響，不能作為玉米粉的有效替代物。喬志剛等[17]在黃河鯉基礎飼料中加入質量分數為2%的懷山藥，發現其能提高黃河鯉特定生長率、增重率，但效果并不顯著，這與本研究山藥皮對鯉無明顯促生長作用的結果相似。分析山藥皮在不同動物上促生長效果差異原因，一方面可能與山藥皮中營養物質和飼料配方中的營養配比不同相關，另外魚類相較于畜禽類，其生長受多方面因素影響，魚體本身的特異性與環境因素亦會影響到飼料添加劑的作用效果。

3.2 山藥皮對淇河鯽血清生化指標的影響

血清生化指標被認為是評價魚類健康水平的重要指標之一，它的含量和變化規律是動物體重要的生物學特征[18]。肝細胞受損，細胞膜通透性增加，血液中谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶濃度增加，可借谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的變化評價藥物的毒副作用[19]。在本研究中，與NC組相比，添加1%濃度山藥皮的實驗組鯽魚血液中谷草轉氨酶的活性顯著降低。表明在飼料中添加山藥皮，可降低淇河鯽血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的活性，具有保肝的功效。這與陳鵬飛等[20]的研究結果相一致。堿性磷酸酶是消化代謝的關鍵酶，廣泛分布于魚體的血液、組織以及各個器官，其活性能反映動物體的生長速度以及生產性能[21]。堿性磷酸酶還是重要的解毒系統[22]，在血細胞溶酶體吞噬和包裹病原體時分泌，對外界微生物入侵起水解破壞效果。研究表明，血液中堿性磷酸酶活性提高，可增強機體對病原的識別和吞噬能力，有利于提高畜禽的生長[20]，鯽血清堿性磷酸酶含量高于NC組，說明魚體的代謝活性增強，利于魚體的生長。

3.3 山藥皮對淇河鯽組織結構的影響

小腸是機體消化、吸收營養物質的主要場所，腸道健康依賴于正常的生理結構，而小腸的腸絨毛長度、肌層厚度則是評價小腸消化吸收能力的重要依據[23]。腸絨毛(intestinal villus)是由固有層和腸上皮細胞向腸腔延伸形成的一個個細小突起，通常呈柱狀或指狀等。絨毛的長度與腸上皮細胞數量呈正相關。腸絨毛長度增加，腸上皮細胞數增多，消化吸收能力增強，生長發育加快[24]。本研究中，實驗組腸絨毛長度及完整性、肌層厚度相較NC組，有一定程度的增加，這表明懷山藥皮對鯽腸道營養物質吸收與促生長方面有正向調節作用。本研究中，相同放大倍數下，實驗組肝細胞與NC組相比，細胞膜與核膜完整性增強；胞質破碎，核溶解、偏移現象消失，說明添加懷山藥皮能一定程度保護并增強肝臟的完整性，作用機制可能與多糖的抗氧化能力相關。在哺乳動物上的研究證實：山藥多糖對肝損傷具有免疫保護作用[25-26]。

3.4 山藥皮對淇河鯽免疫相關基因的影響

緊密連接蛋白Claudin-1是腸粘膜機械屏障的重要組成部分，在調節上皮細胞通透性、阻礙毒性大分子通過等維護腸道屏障功能方面發揮著關鍵作用[27]。有研究報道，石斛多糖、巖藻多糖均可上調哺乳動物腸上皮細胞中Claudin-1的mRNA表達量，保護和增強腸上皮細胞功能[28，29]。此外，酚類化合物也可影響緊密蛋白結合的能力，提高腸上皮屏障完整性[30]。本研究中，山藥皮的添加增加了Claudin-1在鯽腸道中的mRNA表達水平，表明山藥皮的添加可增強對鯽腸道屏障的保護作用。

過氧化氫酶(CAT)是一類末端氧化酶，可通過清除自由基和降低氧化應激，預防、阻止或減少氧化損傷，來保護機體免受疾病的侵襲[31]。而谷胱甘肽轉移酶(GST)的作用是保護細胞免受過氧化損傷，維持細胞內氧化還原狀態的平衡，防止外界刺激引起的脂質過氧化損傷加劇。本研究中，隨著山藥皮添加濃度增大，肝臟GST表達量有上升趨勢，并且CATmRNA水平顯著高于對照組，這說明添加懷山藥皮可以增強機體抗氧化能力，減少氧化損傷。

Toll樣受體是連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁，能通過增加細胞因子的合成和釋放促發炎癥反應，其中TLR4是與免疫相關的模式識別受體，可以識別并結合革蘭氏陰性菌細胞壁脂多糖，激活NF-κB信號通路，活化巨噬細胞，誘導炎性細胞因子表達[32]。促炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等，在魚類早期感染和炎癥調節中發揮重要作用，可通過炎性反應提高機體抗感染能力。抑炎性細胞因子如IL-10，參與多項免疫調節反應，抑制細胞因子的過度釋放，控制炎癥過程[33]。有研究表明，多糖作為一種有效的免疫刺激物，直接參與巨噬細胞的活化[34]，通過與靶細胞上的受體結合引起免疫反應，從而提高魚體的免疫應答和抗病性。在本實驗中，添加1%或2%山藥皮可一定程度下調鯽肝臟、中腸IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達，上調IL-10、TLR4、NF-κB mRNA表達，表明山藥皮有提高機體免疫功能，抑制炎癥反應的作用。其機制可能是山藥多糖刺激巨噬細胞，通過調節TLR4/NF-κB信號轉導通路，下調Th1細胞分泌炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，同時上調Th2抑炎性細胞因子IL-10的表達，平衡Th1/Th2穩態[35]。

綜上所述，在飼料中添加懷山藥皮，能在一定程度上提高鯽肝臟細胞的完整性、促進腸道腸絨毛長度和肌層厚度增加，對炎性細胞因子起到調控作用，從而增強鯽免疫力，加強肝臟和腸道屏障的保護作用。