339株非結核分枝桿菌臨床分離株菌種鑒定及耐藥性分析

秦中華 景曄 杜巖青 宋曉梅 張麗霞

非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌,迄今已發現170多種[1],同時還有新的種別不斷被發現。與專性致病菌結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌不同，絕大多數NTM是環境微生物，通常作為機會性病原體，引起局部(皮膚和軟組織、淋巴結、骨骼、肺)或播散性感染[2]。從我國結核病流行病學調查資料顯示，NTM分離率由1979年的4.3%上升至2000年的11.1%，到2010年的21.0%，反映了我國的NTM病呈明顯上升的態勢[3]。有研究顯示，NTM對常用的治療藥品耐藥,導致NTM病的治療較為困難,且治療效果不理想[4]。因此，筆者了解天津海河醫院NTM病流行狀況及耐藥性特征，為臨床NTM病的診斷和治療提供參考。

資料和方法

一、 研究對象

天津市海河醫院2014年3月至2019年3月應用“DNA微陣列芯片技術”進行菌種鑒定確定的339株NTM。菌株來源于同一患者多次送檢樣本不重復計算，且選擇初次實驗室結果納入統計分析。其中包括痰271份，肺泡灌洗液49份，胸腔積液13份、肺組織穿刺研磨標本6份。

二、實驗方法

(一)分枝桿菌培養及初步菌種鑒定

分枝桿菌培養采用BACTEC MGIT 960 系統及配套基礎培養基(美國BD公司)，陽性培養物采用對硝基苯甲酸(PNB)鑒別培養基(杭州創新生物技術有限公司)進行初步NTM鑒定。初步鑒定為NTM的菌株進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)及分枝桿菌菌種鑒定試驗。

(二)藥敏試驗

藥敏試驗采用比例法，藥品種類和濃度分別是異煙肼(0.2 μg/ml)、利福平(40 μg/ml)、鏈霉素(4 μg/ml)、乙胺丁醇(2 μg/ml)、對氨基水楊酸(1 μg/ml)、卡那霉素(30 μg/ml)、卷曲霉素(40 μg/ml)、氧氟沙星(3 μg/ml)。

(三)分枝桿菌菌種鑒定

1.方法：DNA微陣列芯片法。

2.儀器：PCR擴增儀、芯片雜交儀、芯片洗干儀(北京博奧生物有限公司)；微型高速離心機(Eppendorf, 5424)。

3.試劑：分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(北京博奧生物有限公司)。

4.操作步驟：參照說明書進行。

結 果

一、 NTM菌種的分布情況

臨床分離的339株NTM菌株經菌種鑒定，排在前3位者分別為：胞內分枝桿菌131株，占38.6%；龜-膿腫分枝桿菌72株，占21.2%；堪薩斯分枝桿菌62株，占18.3%(表1)。

表1 339株NTM 菌種鑒定結果

二、不同NTM菌種的藥敏試驗結果

對羅氏培養出的菌株經“DNA微陣列芯片技術”進行菌種鑒定，并對鑒定出的NTM菌株用比例法對8種抗結核藥品(異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星)進行藥敏試驗，結果：胞內分枝桿菌對上述藥品的耐藥率分別為95.6%、82.3%、94.7%、54.0%、92.0%、81.3%、85.3%、87.5%；堪薩斯分枝桿菌對上述藥品的耐藥率分別為100.0%、3.7%、98.1%、11.1%、95.0%、90.0%、27.5%、13.8%；龜-膿腫分枝桿菌對上述藥品的耐藥率分別為96.9%、93.8%、95.3%、92.2%、88.4%、86.0%、88.4%、87.1%(表2)。

討 論

NTM廣泛存在于水、土壤和灰塵等自然環境中，某些NTM(如鳥分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌和龜分枝桿菌)對消毒劑及重金屬耐受，使其生存于飲水系統中，其大部分為腐物寄生菌。在供熱、供水管道中可分離到嗜熱的蟾蜍分枝桿菌、耐熱分枝桿菌和緩黃分枝桿菌等。NTM病以潮熱地帶為多見，人和某些動物均可感染。目前尚未發現動物傳染人以及人與人之間傳播的證據。現在普遍認為，人可從環境中感染NTM而致病，水和土壤是重要的傳播途徑[12]。迄今已發現170余種 NTM，其中 37 種已見致病報道[5]。隨著檢測手段的提高NTM的分離率逐年上升[3]，同時NTM病患者在臨床癥狀、影像學表現等方面與肺結核都十分相似，往往導致臨床醫生錯誤判斷；使得需要很長的治療時間，但是治療效果較差。所以，如何快速準確地檢測確定是否為NTM感染就顯得尤為重要。目前，國內外大多數實驗室采對用硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)生長實驗作為初步鑒別NTM的方法，操作簡單，費用低廉[6]，但其報告時間長，且只能初步篩選NTM，無法滿足臨床的需求。本研究采用DNA微陣列芯片法進行NTM菌種鑒定，可在短時間提供臨床菌種信息，從而使經驗用藥改為目標用藥，為臨床精準治療提供依據。

表2 339株NTM臨床分離株中不同菌種對常用藥品的耐藥率

注表中小括號內數值分子為 “耐藥菌株數”，分母為“檢測菌株數”。菌株數<15株的菌種采用“耐藥菌株數/檢測菌株數”表示;a：未檢測

本研究發現臨床分離出的339株NTM主要是胞內分枝桿菌(38.6%)、龜-膿腫分枝桿菌(21.2%)、堪薩斯分枝桿菌(18.3%),與吳海良等[7]統計的山東地區NTM菌種病原譜分布情況一致，與廣東地區[8]、上海地區[9]報告的 NTM菌種分布資料不同。這可能是地區性差異或臨床分離株數量少[9]、病種分布不同所造成。

多數NTM對抗結核藥品耐藥，用抗結核藥品治療療效不佳。而NTM細胞表面的高疏水性及細胞壁通透屏障是其廣譜耐藥的生理基礎，是有效化療的障礙。為了克服藥品進入細胞的屏障，主張應用破壞細胞壁的藥品(如乙胺丁醇)與抑制細菌蛋白質(酶)的合成的藥品(如鏈霉素)、阻礙細菌mRNA合成的藥品(如利福平)聯用。其原因為鏈霉素和利福平都是殺菌藥，鏈霉素的主要作用機制是通過阻止氨基酰tRNA與細菌核糖體30S亞單位的結合，從而抑制蛋白質合成時肽鏈的移位；利福平親脂性高，很容易通過分枝桿菌的細胞膜，通過與DNA依賴的RNA聚合酶β亞基的rpoB基因結合從而抑制轉錄。乙胺丁醇是一個抑菌藥，對分枝桿菌細胞壁的破壁作用，有效地促進了其他藥品進入細菌體內的速度，提升了胞內的藥品濃度，與其他的抗結核藥品有協同的作用，而且可以延緩其他藥品耐藥性的產生。大多數 NTM 對常用的抗分枝桿菌藥品耐藥，因此，NTM病的治療較為困難，且療效大多不理想[10]。本研究數據顯示，臨床分離的NTM菌株對一線、二線抗結核藥品總的藥耐率在50%以上，這與吳海良等[7]報道的山東地區和張娟等[11]報道的沈陽地區NTM臨床耐藥情況基本一致。

本研究數據顯示，作為主要臨床NTM分離株的堪薩斯分枝桿菌對乙胺丁醇、利福平、卷曲霉素、氧氟沙星具有很好的敏感性，這與中華醫學會結核病學分會《非結核分枝桿菌病診斷和治療》[12]專家共識推薦，對未經治療的堪薩斯分枝桿菌病患者，僅需進行利福平藥敏試驗的指導意見一致；但胞內分枝桿菌和龜-膿腫分枝桿菌對上述藥品均具有較高的耐藥性，提示臨床進行經驗治療過程中應該注意藥品的選擇和菌種的鑒定。

綜上所述，隨著臨床重視度及實驗室診斷技術的不斷提高，NTM臨床分離率呈現逐年增高趨勢，同時感染后臨床表現與結核分枝桿菌臨床表現極為相似，但對常用抗結核藥品又大部分具有耐藥性，因此對NTM進行快速準確的鑒定和藥敏試驗有助于精準地對NTM病實施臨床治療。