辣椒基因組SSR引物的開發(fā)及品種純度分子鑒定

盧霞　鄧志軍　劉夢華　趙玉虎　司龍亭　李文虎　阿門

摘要：辣椒是世界上重要的蔬菜作物之一，基因組簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）標記的開發(fā)對于辣椒分子育種和雜交種子純度檢測具有重要意義。為了檢測辣椒品種綠隴3號雜交種子的純度，基于辣椒全基因組序列開發(fā)了75對SSR標記。結(jié)果表明，只有SSR標記p50對父母本的擴增結(jié)果表現(xiàn)為帶型清晰、共顯性，且具有高多態(tài)性，可進一步用于雜交種的純度檢測。為了確保標記p50的準確性和可靠性，對其PCR產(chǎn)物進行了進一步測序。測序結(jié)果表明，在父母本中分別擴增出了251、293 bp的序列。用標記p50對綠隴3號辣椒進行純度檢測，結(jié)果顯示，種子純度為100%，鑒定結(jié)果與田間純度一致。新SSR 分子標記的開發(fā)，為辣椒雜交種子純度的鑒定提供了參考，也為辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子育種研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒;SSR;分子標記;種子純度鑒定

中圖分類號： S641.303文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0065-04

辣椒（Capsicum annuum L.）屬于茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum），是我國的主要蔬菜作物之一，既可鮮食，又是重要的調(diào)料。辣椒品種的好壞對其產(chǎn)量及品質(zhì)均有直接而明顯的影響，因而辣椒新品種的選育至關(guān)重要。利用雜種優(yōu)勢選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的雜交種，是辣椒育種中行之有效的途徑。目前，我國辣椒生產(chǎn)已經(jīng)廣泛使用雜交種，但是在實際制種過程中，由于人工去雄不及時、外來花粉干擾、母本自交、機械混雜等均影響了種子純度，因此，為了保證辣椒種子的質(zhì)量，純度鑒定是種子銷售中不可或缺的重要步驟[1]。在傳統(tǒng)的形態(tài)學角度，辣椒種子的純度鑒定主要依賴于果型、株型、絨毛等田間表型，其檢測周期長、用地多，不僅費時費工，而且易受環(huán)境因素的影響，難以滿足當年的生產(chǎn)需求。

近年來，分子生物學的發(fā)展使種子純度鑒定進入基因水平。用分子標記鑒定種子純度采用電泳方法檢測基因組DNA的結(jié)構(gòu)與組成，通過分析DNA水平上的差異來檢驗品種純度與真實性，其遺傳性穩(wěn)定、多態(tài)性高，不受發(fā)育階段、取材部位等環(huán)境因素的制約，目前DNA分子標記技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于辣椒、番茄、茄子、黃瓜、西葫蘆、西瓜等主要蔬菜作物的鑒定與純度檢測中[2-8]。目前，在利用DNA分子標記檢測辣椒種子純度方面已有部分研究，劉子記等對辣椒雜交種簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）分子標記鑒定結(jié)果及表型鑒定結(jié)果進行比較分析，結(jié)果表明，篩選出的SSR分子標記可用于熱辣3號雜交種純度的快速鑒定[9];張曼用篩選出的標記CA885分別對2份辣椒品種F1代雜交種的96株單株進行純度檢測，檢測結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致[10]。辣椒全基因組測序的完成[11-13]，不僅有助于了解辣椒基因組的結(jié)構(gòu)與功能，而且對于辣椒SSR位點的開發(fā)、加速辣椒育種進程都有重要的指導(dǎo)作用。隨著更多辣椒SSR位點得到開發(fā)及研究應(yīng)用，有望進一步推動SSR標記在種子純度檢驗、遺傳育種中的應(yīng)用[14]。

本研究以江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司選育的辣椒品種綠隴3號為試驗材料，基于辣椒基因組序列，設(shè)計開發(fā)了1批SSR引物，篩選其中具有多態(tài)性、特異性強、重復(fù)性好的SSR引物，對綠隴3號雜交種子進行分子純度鑒定，初步建立辣椒雜交種種子室內(nèi)純度鑒定的SSR體系，以期為辣椒雜交種子的純度鑒定及品種遺傳多樣性分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用辣椒品種購自江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，以綠隴3號的F1代及母本、父本種子作為試驗材料，取144粒F1代種子、各12粒父母本種子播在穴盤中，在育苗棚中育苗，待長出第1張真葉時進行試驗。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

辣椒基因組DNA的提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法[15]。取30 mg幼嫩葉片放入2 mL離心管中，加入1個直徑為4 mm的鋼珠，蓋緊蓋子后將其放入液氮中90 s，然后用組織研磨儀磨樣;在磨好的樣中加入600 μL三氯甲烷CTAB緩沖液，55 ℃水浴20 min;12 000 r/min離心1 min，吸取400 μL 上清于干凈的1.5 mL離心管中，加入350 μL體積比為24 ∶[KG-*3]1的三氯甲烷-異戊醇溶液，充分混勻;12 000 r/min離心1 min，取300 μL上清于另1個干凈的1.5 mL離心管中，加入500 μL無水乙醇（提前于-20 ℃預(yù)冷）與50 μL乙酸銨，混勻，于-20 ℃冰箱放置2 h;13 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，將離心管放置于室溫條件下;待離心管中無乙醇味時，加入100 μL ddH2O溶解DNA。分別用超微量紫外可見分光光度計與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的濃度與質(zhì)量。

1.3 SSR分子標記的開發(fā)

從茄科基因組數(shù)據(jù)庫（Sol Genomics Network）中下載辣椒的全基因組序列，通過Pilot Edit軟件與SSR搜索工具SSR Hunter軟件在基因組序列中有目的地搜索包含SSR位點的序列，以二、三、四、五、六核苷酸基序（motif）的最少重復(fù)次數(shù)在10次以上作為標準進行SSR位點序列的選擇。用Primer 5設(shè)計引物，引物設(shè)計參數(shù)如下：引物長度為18～30 bp，最適長度為22 bp，正反引物的長度相差不超過3 bp，退火溫度為50～60 ℃，GC含量在40%左右，PCR預(yù)擴增產(chǎn)物大小為100～300 bp。引物由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR擴增與檢測

PCR采用15 μL體系，包含1 μL DNA模板、7.5 μL Taq Mix、各1 μL正反向引物、4.5 μL ddH2O。PCR擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán);72 ℃ 延伸2 min，16 ℃終止反應(yīng)。

擴增完成后，將擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳完成后，進行硝酸銀溶液染色、氫氧化鈉甲醛溶液顯色。在自然光下，對每對引物擴增出來的條帶進行判斷，當某對引物的擴增條帶在父母本中具有多態(tài)性，并在F1代中同時顯示出父母本的特征條帶時，則確定該引物可用于純度鑒定，否則表明該引物不適合用于鑒定雜交種的純度。

1.5 SSR標記的克隆與測序

為了驗證所選標記片段的大小，對父母本進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行膠回收，然后連接至pMD19-T載體上，送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物的篩選

利用筆者所在公司自主開發(fā)的75對SSR標記對辣椒品種綠隴3號及其父母本進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳。由圖1可以看出，標記p50在綠隴3號父母本中都能擴增出清晰的條帶，且在綠隴3號中表現(xiàn)為父母本帶型互補的條帶。重復(fù)試驗結(jié)果表明，標記p50擴增的帶型穩(wěn)定、多態(tài)性高，且為共顯性標記。

2.2 新開發(fā)標記p50的序列信息及相應(yīng)測序結(jié)果

2.2.1 標記p50的序列信息 以栽培辣椒品種Zunla-1全基因組序列開發(fā)的標記p50的序列信息見表1。

2.2.2 標記p50擴增DNA的測序結(jié)果 為了在分子水平上確定所選SSR標記的準確性與可靠性，對用標記p50擴增的DNA片段進行了測序。由圖2的測序結(jié)果看出，綠隴3號父母本存在42 bp的序列差異，在其母本中擴增出了293 bp的序列，而在其父本中擴增出了251 bp的序列，父母本對應(yīng)的差異序列為（GAG）1與（AAG）13。該結(jié)果與聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果完全一致，因此，本試驗選用標記p50來鑒定綠隴3號辣椒的種子純度。

2.3 雜交種綠隴3號的純度鑒定

隨機選取144粒綠隴3號的種子，在育苗棚中育苗后，提取其葉片基因組DNA，并以標記p50作為引物進行SSR擴增，檢測辣椒綠隴3號的純度。結(jié)果表明，綠隴3號所有種子均呈父母本互補帶型（圖3），雜交種子的純度達到100%。進行大田種植后，根據(jù)植株的表型鑒定結(jié)果，在136株綠隴3號群體中，有2株的表型表現(xiàn)與親本一致，田間鑒定得到的種子純度為98.5%，與分子標記鑒定的結(jié)果基本一致。

3 討論

種子純度鑒定是商業(yè)育種中必不可少的重要步驟，是衡量種子質(zhì)量的關(guān)鍵。辣椒是我國的重要蔬菜作物之一，每年通過傳統(tǒng)的田間試驗來鑒定其純度雖然有效，但是效率太低，不僅費時費力，且易受外界環(huán)境因素的影響。而利用分子標記技術(shù)，可以快速高效地完成種子純度鑒定，不但節(jié)約了種子公司的成本，為市場提供了優(yōu)質(zhì)種子，還對我國的辣椒育種具有重要的指導(dǎo)意義[1]。隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標記技術(shù)已經(jīng)成為作物品種真實性和純度鑒定的發(fā)展方向。目前，SSR分子標記技術(shù)在蔬菜作物品種鑒定與純度檢測方面已得到了廣泛應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外學者對辣椒全基因組測序的完成，為SSR標記的開發(fā)提供了新途徑，使引物開發(fā)費用逐漸降低[11，13]，更多的辣椒SSR位點被開發(fā)，將進一步推動SSR標記在種子純度檢驗、遺傳育種及其他研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本研究基于栽培辣椒品種Zunla-1全基因組序列信息，開展了辣椒SSR位點的挖掘與設(shè)計，開發(fā)了75對SSR引物，并篩選出了1對特異性條帶清晰、多態(tài)性強、便于識別、方便對辣椒雜交種綠隴3號進行種子純度分析的SSR引物p50。新開發(fā)的標記p50在基因組中的起始位點為第606399 bp，重復(fù)單元為AAG，重復(fù)了26次。但是有趣的是，對綠隴3號親本的測序結(jié)果顯示，雙親存在42 bp的序列差異，且母本序列比基因組參考序列多12個GAA與1個GAG序列，而父本序列較參考序列少1個GAA序列，這與p50的重復(fù)單元及數(shù)量并不相同，表明GAG可能是1個高變異位點，因而在不同辣椒品種中的存在模式有差異。本研究結(jié)果可用于親緣關(guān)系較近的種質(zhì)資源遺傳分析研究。

本研究用標記p50對綠隴3號及其父母本進行SSR擴增后，能夠準確地將父母本、雜交種及假雜種區(qū)分開來，綠隴3號種子的純度為100%，與田間表型鑒定的結(jié)果高度一致。為了確保鑒定結(jié)果的準確性和可靠性，對綠隴3號父母本的擴增產(chǎn)物進行測序后，在母本中檢測出了293 bp的序列，在父本中檢測出了251 bp的序列，該測序結(jié)果與電泳結(jié)果完全一致，表明新開發(fā)的標記p50符合綠隴3號的DNA特點，篩選出的引物針對性強，適用于綠隴3號辣椒雜交種純度的鑒定。綜合分析可知，本研究結(jié)果為親緣關(guān)系較近的辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子標記輔助育種研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]白占兵，李雪峰，戴雄澤. 利用SSR分子標記建立辣椒純度鑒定體系[J]. 辣椒雜志，2010（1）：32-34.

[2]王 飛，姚明華，尹延旭，等. 辣椒SSR多態(tài)性引物的篩選及品種純度鑒定[C]//中國園藝學會.中國園藝學會2017年論文摘要集. 2017：126.

[3]盧國強，盧海林，潘學春，等. 辣椒品種鎮(zhèn)研22種子純度的SSR分子比較鑒定[J]. 辣椒雜志，2017（2）：33-35.

[4]張錄霞，甘中祥，李倍金，等. 利用InDel標記鑒定加工番茄雜交種純度[J]. 分子植物育種，2016，14（6）：1533-1537.

[5]劉 軍，周曉慧，莊 勇. 茄子雜交品種種子純度的SSR分子標記鑒定[J]. 分子植物育種，2013，11（6）：790-794.

[6]周勝軍，張 鵬，朱育強，等. 黃瓜‘浙秀1號種子純度的SSR鑒定[J]. 分子植物育種，2013，11（5）：557-561.

[7]林春晶，張春寶，董英山. DNA分子標記在作物雜交種純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2015，13（3）：702-710.

[8]李超漢，劉 莉，劉 翔，等. 基于SSR標記的5個西瓜新品種純度鑒定及特異性分析的研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2015，31（33）：177-185.

[9]劉子記，李靜婷，楊 衍，等. 辣椒雜交種SSR分子標記鑒定及表型比較分析[J]. 華北農(nóng)學報，2014，29（1）：69-72.

[10]張 曼. 基于分子標記的辣椒雜交種真實性和純度的檢驗[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學，2012.

[11]Qin C，Yu C S，Shen Y，et al. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization[J]. PNAS，2014，111（14）：5135-5140.

[12]Lee J M，Nahm S H，Kim Y M，et al. Characterization and molecular genetic mapping of microsatelliite loci in pepper[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（4）：619-627.

[13]Kim S，Park M，Yeom S I，et al. Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species[J]. Nature Genetics，2014，46（3）：270-278.

[14]杜培粉. 14個辣椒雜交種純度鑒定的SSR引物篩選[J]. 長江蔬菜，2017（14）：46-49.

[15]Aljanabi S M，Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（22）：4692-4693.