一株拮抗水稻條斑病菌的蠟樣芽孢桿菌的分離和鑒定

李生樟　劉昭　楊瑞環　陳穎　鐘佑寧　陳路生　屈伊凝　陳功友　鄒麗芳

摘要：水稻條斑病菌（Xanthomolias oryzae pv. oryzicola，Xoc）侵染水稻，引起細菌性條斑病（bacterial leaf streak，簡稱BLS），嚴重威脅水稻的安全生產。為篩選防治BLS的生防細菌，以Xoc的模式菌株RS105為靶標菌，采用平板稀釋和抑菌圈法，從大白菜根際土壤中分離篩選到具有拮抗活性的細菌菌株512。通過形態學、生理生化特征以及16S rDNA和gyrB序列分析，鑒定菌株512為蠟樣芽孢桿菌，命名為Bacillus cereus 512。抑菌試驗顯示，B. cereus 512對黃單胞菌屬不同種細菌的拮抗活性存在較大差異，其中對水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，簡稱Xoo）的拮抗效果最強。發酵液的穩定性試驗表明，抑菌活性物質對高溫和蛋白酶不敏感，耐強堿不耐強酸。在原豐早水稻品種上，針對水稻條斑病防治的初步試驗結果顯示，B. cereus 512對Xoc在水稻葉片上引起的水漬癥狀的擴展具有明顯的抑制作用。綜上所述，B. cereus 512能夠拮抗Xoc和Xoo，在BLS的生物防治中將具有較大的應用潛力。

關鍵詞：水稻條斑病菌;水稻白葉枯病菌;蠟樣芽孢桿菌;生物防治;拮抗活性

中圖分類號： S435.111.4+9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0127-09

水稻條斑病菌（Xanthomolias oryzae pv. oryzicola，簡稱Xoc）是水稻黃單胞菌種下的變種，能侵染水稻，引起水稻細菌性條斑病（bacterial leaf streak，簡稱BLS）[1]。在我國南方水稻產區，條斑病已逐漸成為水稻上的第四大病害，每年造成10%～30%的減產，嚴重威脅水稻的安全生產[2-3]。Xoc與水稻的互作不符合基因對基因關系，一些含有xa5[4]、Xa23[5]和Xa21[6]等抗性基因的水稻品種對白葉枯病菌（X. oryzae pv. oryzae，簡稱Xoo）具有較好抗性，但對Xoc均表現為感病。我國的一些雜交水稻品種對Xoc表現為感病，其中有些為高度感病[7]。目前，BLS的防治主要依賴于化學藥劑，如噻唑類殺菌劑等[8]。這些化學藥劑的使用容易使病原菌產生抗藥性，且可破壞生態環境[9]。近年來，隨著生物防治措施的提倡和推廣，從農業生態環境中篩選拮抗微生物來防治BLS的研究成為熱點。

目前，應用最廣泛的生防細菌主要包括鏈霉菌（Streptomyces spp.）、假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）以及芽孢桿菌（Bacillus spp.）等[10]，其中芽孢桿菌因具有良好的抗逆性和抗菌活性物質多樣性被廣泛應用于植物病害的生物防治。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種需氧的芽孢桿菌，主要分布于水、土壤、植物根圍、動物腸道等環境中，是引起食物污染和食物中毒的主要病原菌。目前有研究表明，B. cereus是土壤中的優勢菌，能促進植物生長，可作植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）[11-12]。B. cereus能分泌多種拮抗真菌、細菌和線蟲的活性物質，被廣泛應用于植物病害的生物防治[13]。在真菌病害的防治中發現，B. cereus具有廣譜的抗菌活性，能夠有效抑制小麥全蝕病菌（Colletotrichum acutatum）[14]、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）[15]、枇杷果實炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioide）[16]、玉米穗腐病菌（Fusarium verticillioides）[17]、百合葉枯病菌（Botrytis elliptica）[18]、苜蓿腐爛病菌（Phytophthora medicaginis）[19]等多種病原真菌的生長。在線蟲病害的防治中發現，B. cereus能夠產生2種拮抗南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）的活性物質，同時，能夠誘導番茄植株產生系統獲得抗性[20-21]。目前，關于B. cereus對水稻黃單胞菌具有拮抗作用的報道較少。

本研究從大白菜根際土壤中分離篩選對Xoc具有拮抗作用的生防菌并對其進行鑒定，分析其對2種水稻黃單胞菌的拮抗作用以及拮抗活性物質的穩定性，初步確定其在水稻組織中是否能夠抑制Xoc引起的水漬狀病斑的擴展，以期為BLS的生物防治以及后續生物農藥的研制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究所用的菌株512是從福建省三明市尤溪縣西濱鎮西洋村大白菜根際土壤中分離得到的。供試的Xoo、Xoc菌株由本試驗收集或者從各省水稻病樣中分離獲得;其他植物病原黃單胞菌為筆者所在實驗室保存的菌株（表1），這些菌株在營養瓊脂（NA）培養基上和營養肉湯（NB）培養基中，于溫度為28 ℃條件下培養。

1.2 拮抗細菌的分離和鑒定

每份土樣稱取10 g，置于三角錐形瓶中，加入90 mL滅菌水和少許鋼珠，在28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養20 min，室溫靜置10 min，制成土壤菌懸液。吸取1 mL菌懸液，依次稀釋成10-3、10-4、10-5 3個濃度梯度[22]。吸取100 μL菌液，均勻涂布在已加入200 μL指示菌株RS105的NA培養基平板上，28 ℃培養24 h后，觀察抑菌圈的形成情況，挑出對RS105具有抑菌活性的菌落，純化為單菌落。吸取50 μL單菌落培養后的菌液，調整其濃度，使其D600 nm（在600 nm處的吸光度）為2.0，進行抑菌活性復篩試驗，保存抑菌圈直徑大于4 cm的菌落，進行后續菌株的鑒定。菌株512是從編號為51的土樣中獲得的，土樣于2018年2月21日采集自福建省三明市尤溪縣西濱鎮西洋村大白菜根際土壤。

將菌株512送至中國典型培養物保藏中心（武漢大學）進行形態學觀察和生理生化特性測定。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[23]對其產酸產氣、檸檬酸利用、糖醇類發酵、色氨酸脫氨酶活性等生理生化特性進行分析。提取菌株512的基因組DNA，采用細菌16S rDNA基因的特異性引物27F和1492R以及持家基因gyrB的引物進行PCR擴增。PCR產物純化后，送至鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序分析。利用NCBI網站的BLAST功能對所測的16S rDNA和gyrB序列進行同源性分析，確定親緣關系，最后使用MEGA（6.0）軟件的近鄰（neighbor_joining）法[24]構建系統發育樹。

1.3 B. cereus 512對黃單胞菌拮抗活性的分析

采用牛津杯法測定B. cereus 512對15株Xoc菌株、12株Xoo菌株以及9株其他黃單胞菌屬病菌菌株的拮抗效果。將各供試黃單胞菌單菌落接種于NB培養基中，在溫度為28 ℃條件下培養24 h后，調節菌液濃度，使其D600 nm 為2.0，吸取200 μL菌液加入到冷卻至45 ℃ 左右的NA培養基中，充分混合。向牛津杯中加入50 μL B. cereus 512發酵液，每個處理設3次重復，置于溫度為28 ℃條件下培養24 h，測量和統計抑菌圈直徑大小。數據采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行統計分析。

1.4 抑菌活性物質的穩定性分析

將B. cereus 512單菌落接種于3 mL NB中，在28 ℃、180 r/min搖床中培養24 h，得到發酵液，調節菌液濃度，使其D600 nm 為2.0。在檢測蛋白酶培養基平板中央放置1個牛津杯，向牛津杯中注入50 μL B. cereus 512發酵液，在28 ℃培養箱中正向培養2 d后觀察結果，并測定酶解圈的直徑，試驗重復3次。

將B. cereus 512單菌落接種于3 mL NB中，在溫度為28 ℃、轉速為180 r/min搖床中培養24 h，得到發酵液。根據參考文獻[26]、[27]的方法分別檢測發酵液經過蛋白酶、酸堿和熱處理后的抑菌活性。向發酵液中分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K，使酶的最終濃度為1 mg/mL，37 ℃ 反應1 h，測定不同蛋白酶處理后發酵液對RS105的抑菌活性，以不加入酶的發酵液為空白對照，測量抑菌圈直徑。調節菌液的pH值為7.0，在此基礎上，用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調節發酵液的pH值為1、3、5、9、11和13，靜置3 h后測定不同酸堿處理后發酵液對RS105的抑菌活性，測量抑菌圈直徑。將發酵液分別在40、50、60、70、80、90、100 ℃等 7個不同溫度下水浴30 min后立即冷卻至室溫。用牛津杯法測定不同高溫處理后發酵液對RS105的抑菌活性，測量抑菌圈直徑，空白對照為未經高溫處理（25 ℃）的發酵液。

1.5 對病害的抑制活性

將Xoc野生型菌株RS105和B. cereus 512單菌落接種至5 mL NB中，在溫度為28 ℃條件下培養24 h，調節RS105的菌液、B. cereus 512菌液濃度使其D600 nm分別為0.3、1.0。采用2種接種方式進行接種，治療處理的接種法：利用無針頭的注射器將RS105菌液（D600 nm=0.3）注射入水稻葉片中，2 h后再注射B. cereus 512菌液（D600 nm=1.0）;預防處理的接種法：先將B. cereus 512菌液（D600 nm=1.0）注射入水稻葉片中，2 h后再注射接種RS105菌液（D600 nm=0.3）。每種方法接種大約10張葉片，連續7 d觀察水漬狀病斑的形成情況，7 d后統計病斑的長度。其中水稻品種為高感Xoc的原豐早，由湖南農業科學院植物保護研究所肖友倫博士提供，種植于上海交通大學水稻溫室中，生長2周左右的水稻苗用于上述接種試驗。

2 結果與分析

2.1 水稻條斑病菌拮抗細菌的分離和鑒定

為從植物根際土壤中篩選出能夠拮抗Xoc的細菌，從全國各省（市、區）收集了107份土樣，以Xoc的模式菌株RS105為指示菌。按照常規的篩選流程篩選了50份土樣，獲得66株具有拮抗活性的細菌，發現菌株512對RS105的拮抗效果非常明顯（圖1-A）。為明確菌株512對Xoc的拮抗活性，選取15株具有代表性的Xoc菌株進行測定，結果發現，菌株512對這些菌株都具有拮抗活性（圖1-B）。

革蘭氏染色反應結果（圖1-C）表明，菌株512為革蘭氏陽性細菌，細胞呈短桿狀，能夠產生橢圓形的芽孢，且能運動。在NA培養基上，菌株512能形成乳白色的菌落，菌落表面粗糙、邊緣不規則、不透明（圖1-D）。進一步生理生化特征分析結果（表2）顯示，菌株512能夠利用檸檬酸，且能夠利用硫代硫酸鈉產生H2S、利用丙酮酸鹽產生乙酰甲基甲醇，能分泌精氨酸雙水解酶、明膠酶;在碳源利用反應中，菌株512能夠利用核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、淀粉、糖原等多種碳源。根據《常見細菌系統鑒定手冊》，這些生理生化特性與芽孢桿菌具有相似性。將菌株512的16S rDNA序列在NCBI網站上進行BLAST分析，發現其與Bacillus cereus、B. wiedmannii、B. albus等菌株的16S rDNA序列具有100%的同源性，系統進化樹分析結果（圖2-A）顯示，它們具有較高的親緣關系。進一步選取持家基因gyrB進行分析，序列比對結果顯示，菌株512的gyrB與蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）的gyrB同源性為99%，據其構建的系統發育樹結果（圖2-B）顯示，菌株512與蠟樣芽孢桿菌親緣關系最近。因此，結合菌株的形態、生理生化特征及分子鑒定結果將菌株512確定為蠟樣芽孢桿菌（B. cereus），命名為蠟樣芽孢桿菌512（B. cereus 512）。

2.2 B. cereus 512對水稻白葉枯病菌及其他黃單脆菌屬病菌的拮抗活性

Xoc和Xoo為水稻黃單胞菌的2個致病變種，為檢測B. cereus 512是否對Xoo也具有拮抗活性，選取12株Xoo菌株進行分析，結果（圖3-A）發現，B. cereus 512對Xoo菌株的拮抗活性非常明顯，且明顯強于對Xoc菌株，其中對YC7和XZ35的拮抗效果最明顯，平均抑菌圈直徑分別達到了65、59 mm。這表明B. cereus 512對Xoo和Xoc都具有抑制活性。

為明確B. cereus 512是否對其他植物病原黃單胞菌也具有拮抗活性，選取9株代表菌株進行測定，結果（圖3-B）發現，B. cereus 512對香蕉枯萎病菌（X. campestris pv. musacearum，簡稱Xcm）、豇豆細菌性疫病菌（X. axonopodis pv. vignicola，簡稱Xav）、[KG*3]辣椒斑點病菌（X.campestrispv.vesicatoria，簡稱Xcv）以及核桃黑斑病菌（X. campestris pv. juglandis，簡稱Xcj）具有明顯的拮抗活性，對棉花角斑病菌（X. campestris pv. malvacearum）和菜豆細菌性疫病菌（X. campestris pv. phaseoli）具有微弱的拮抗活性，對洋蔥細菌性葉枯病菌（X. axonopodis pv. allii）、甘蔗流膠病菌（X. axonopodis pv. vasculorum）和大豆斑疹病菌（X. axonopodis pv. glycines）不存在拮抗活性。這些結果表明，B. cereus 512對黃單胞菌屬不同種細菌的拮抗活性存在較大差異，其中對水稻黃單胞菌Xoo和Xoc的效果最為明顯。

2.3 B. cereus 512抑菌活性物質的特性分析

進一步分析B. cereus 512抑菌活性物質的穩定性，結果（圖4）發現，B. cereus 512能夠分泌水解牛奶的蛋白酶，將其發酵液經過蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后，仍具有拮抗Xoc的活性，據此推測，B. cereus 512拮抗Xoc的活性物質可能不是蛋白類物質。pH值為7時，發酵液具有較好的拮抗活性，在此基礎上進行酸堿調節，當pH值為1時，發酵溶液拮抗Xoc的活性顯著降低，在pH值為3、5的酸性環境以及pH值為9、11、13等堿性條件下，發酵溶液仍具有較好的抑制Xoc的活性。將發酵液進行40、50、60、70、80 ℃等5種不同高溫處理后，其拮抗Xoc的活性與室溫（25 ℃）下相比沒有明顯的變化，在90 ℃和100 ℃ 2種溫度處理下，發酵液的拮抗活性喪失。綜上所述，B. cereus 512的抑菌活性物質能耐堿不耐強酸，具有熱穩定性，能耐90 ℃以下的高溫。

2.4 B. cereus 512對BLS水漬癥狀的抑制作用分析

為測定B. cereus 512對Xoc的抑制效果，利用高感Xoc的原豐早水稻品種，采用苗期注射接種法，在水稻葉片中同時接種B. cereus 512和RS105菌株。接種5 d后發現，野生型RS105、B. cereus 512治療處理（RS105/512）和預處理（512/RS105）的水稻葉片出現水漬狀病斑（圖5-A）;接種7 d后，與野生型RS105處理相比，預防接種（512/RS105）引起的水漬狀病斑長度顯著變短（圖5-A和圖5-B）。這表明B. cereus 512含有的抑菌活性物質在水稻組織中能夠有效抑制Xoc引起的水漬狀病斑的擴展。

3 討論

本研究從大白菜根際土壤中篩選得到1株蠟樣芽孢桿菌B. cereus 512，該菌株對Xoc和Xoo具有明顯的拮抗活性，其發酵液能夠耐高溫和蛋白酶降解，為水稻黃單胞菌的生物防治提供了新的微生物資源。

根據形態、生理生化特征將菌株512鑒定為芽孢桿菌。利用16S rDNA序列進行分析發現，其與B. cereus、B. wiedmannii和B. albus等菌株16S rDNA的序列具有100%的同源性，無法有效確定其分類地位。進一步選取持家基因gyrB進行分析發現，菌株512和B. cereus gyrB基因的同源性為99%;系統發育樹分析結果表明，兩者親緣關系最近。因此，結合形態、生理生化特征及分子鑒定將512確定為B. cereus，命名為蠟樣芽孢桿菌512（B. cereus 512）。很多芽孢桿菌如B. velezensis很容易被鑒定為B. subtilis或者B. amyloliquefaciens[28]。在利用分子技術進行鑒定時，除了考慮16S rDNA序列之外，也需要結合一些持家基因（例如gyrA或者gyrB）進行同源性分析。

已有研究顯示，B. cereus能夠促進植物生長、抗真菌[18]和線蟲[20-21]，且能夠產生超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，簡稱SOD），誘導植物的系統抗病性[16]，對于病原真菌如輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）[17]、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）[29]以及引起花生仁產后腐爛的曲霉真菌（Aspergillus flavus）[30]等具有明顯的抑制作用，已成功應用于生產實踐。但關于B. cereus對植物病原黃單胞菌具有拮抗活性的報道較少。本研究發現，B. cereus 512可以抑制Xcm、Xav、Xcv和Xcj的生長，對于Xoo和Xoc的抑制效果最明顯。張榮勝等曾利用解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）LX-11菌株來防治BLS，防治效果可達60.2%[31]。本研究發現，B. cereus 512在水稻葉片中能夠抑制Xoc的生長，限制條斑病癥狀的擴展。這預示著B. cereus 512也具有防治BLS的潛力，但是在田間是否具有生防潛力，還需要進一步的試驗論證。

菌株512的發酵液雖具有蛋白酶活性，但抑制Xoc的活性物質能耐蛋白酶解和高溫，在pH值為3～13之間都能夠維持穩定的抑菌活性。這表明，B. cereus 512拮抗Xoc的活性物質不是蛋白類和常見的脂肽類化合物，是否為新的化合物還有待于進一步分析。

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