干姜及其炮制品色差值與活性成分含量的相關性研究

林華堅 張梓豪 孟江 王淑美

中圖分類號 R283 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）10-1197-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.10.08

摘 要 目的：評價干姜及其炮制品色差值與活性成分含量的相關性。方法：采用高效液相色譜法測定6種活性成分的含量，采用色彩色差計測定干姜及其炮制品的色差值[明度（L*）、紅綠色軸分量（a*）、黃藍色軸分量（b*）]。采用SPSS 24.0軟件對色差值與活性成分含量進行相關性分析。結果：姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇和10-姜酚檢測質量濃度的線性范圍分別為2.65～105.90、10.15～406.00、4.87～194.80、5.28～211.20、6.14～245.70、7.02～280.80 μg/mL（r均大于0.999）;定量限分別為7.46、13.68、14.37、16.62、17.03、17.99 ng，檢測限分別為2.24、4.11、4.31、4.99、5.11、5.40 ng;精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于3%;平均加樣回收率分別為101.34%、102.14%、101.22%，103.12%、103.74%、103.54%，103.06%、98.55%、99.43%，99.36%、103.51%、101.21%，100.85%、99.42%、99.60%，100.39%、97.69%、103.84%（RSD均小于3%，n=3）;含量分別為0～0.66、0.06～7.57、0.03～1.45、0.29～3.47、0.15～2.85、0.04～2.83 mg/g。色差值L*、b*與干姜不同炮制程度呈極顯著負相關（P<0.01），a*與炮制程度呈正相關（P<0.05）;干姜炮制前后L*、b*與姜酮含量呈極顯著負相關，與其余5種成分呈極顯著正相關（P<0.01）;a*與姜酮呈極顯著正相關（P<0.01），與其余5種成分無相關性（P>0.05）;干姜及其炮制品與姜酮含量呈極顯著正相關，與其余5種成分含量呈極顯著負相關（P<0.01）。結論：干姜及其炮制品的色差值與其活性成分含量相關，即隨炮制程度的加重，其a*增加，L*、b*降低;姜酮含量升高，6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚含量降低。

關鍵詞 干姜;炮制品;高效液相色譜法;色彩色差計;活性成分;含量;色差值;相關性分析

Correlation Study of Color Difference Values and Active Constituent Contents in Crude and Processed Zingiber officinale

LIN Huajian，ZHANG Zihao，MENG Jiang，WANG Shumei（School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University/Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica， State Administration of Traditional Chinese Medicine/Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of Guangdong Universities， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To evaluate the correlation between color difference values and active constituent contents of crude and processed Zingiber officinale. METHODS： HPLC method was adopted to determint the content of 6 active constituents. The color difference values of crude and processed Z. officinale [lightness （L*）， red-green axis component （a*）， yellow-blue axis component （b*）] were determined by chromatic aberration meter. SPSS 24.0 software was adopted for the correlation analysis between color difference values and active constituent contents. RESULTS： The linear range of zingiberone， 6-gingerol， 8-gingerol， 6-shogaol， diacetoxy-6-gingerol and 10-gingerol were 2.65-105.90， 10.15-406.00， 4.87-194.80， 5.28-211.20， 6.14-245.70， 7.02-280.80 μg/mL （r>0.999）. The limits of quantification were 7.46，13.68，14.37，16.62，17.03，17.99 ng， and the limits of detection were 2.24，4.11，4.31，4.99，5.11，5.40 ng， respectively. RSDs of precision， stability， and repeatability tests were all lower than 3%. The average recovery rates were 101.34%， 102.14%， 101.22%; 103.12%， 103.74%， 103.54%; 103.06%， 98.55%， 99.43%; 99.36%， 103.51%， 101.21%; 100.85%， 99.42%， 99.60%; 100.39%， 97.69%， 103.84% （RSD were all lower than 3%，n=3）， respectively. The contents of them were 0-0.66， 0.06-7.57， 0.03-1.45， 0.29-3.47， 0.15-2.85， 0.04-2.83 mg/g， respectively. L* and b* values were negative correlated with the processing degree of Z. officinale significantly （P<0.01）， a* showed a significantly positive correlation with the processing degree （P<0.05）. L*and b* values showed a significantly negative correlation with the content of zingiberone before and after processing， but positively correlated with the other five components （P<0.01）. a* showed a significantly positive correlation with the content of zingiberone， but had no correlation with other five components （P>0.05）. The crude and processed Z. officinale were positive correlated with the content of zingiberone， negatively correlated with other five components （P<0.01）. CONCLUSIONS： There is a certain correlation between the color difference values of crude and processed Z. officinale and the contents of their active constituents. With the deepening of the processing， a* values is increased， L* values and b* values is decreased; the content of zingiberone increases， the contents of 6-gingerol， 8-gingerol， 6-shogaol， diacetoxy-6-gingerol， 10-gingerol reduce.

KEYWORDS? ?Crude Zingiber officinale; Processed product; HPLC; Chromatric aberration meter; Active constituent; Content; Color difference values; Correlation analysis

干姜為姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的干燥根莖，是一種藥食同源的常見中藥。該藥性辛、熱，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效[1]。干姜在臨床上使用的炮制品種包括炮姜和姜炭，其中炮姜辛燥之性較干姜弱，但溫經作用緩和持久，用于溫經止痛[2];姜炭辛味消失，溫經作用弱于炮姜，長于止血[2]。干姜及其炮制品主要含有姜辣素類活性成分，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、姜酮、二乙酰氧基-6-姜二醇等化合物[3-5]，具有抗氧化、解熱抗炎、改善心血管系統等作用[6]。目前，干姜及其炮制品的質量控制主要包括6-姜酚的含量測定和傳統的性狀、顏色鑒別[1]。2015年版《中國藥典》（一部）對干姜、炮姜和姜炭的顏色鑒別描述分別為“表面灰黃色”“表面棕褐色”“表面黑色”[1]，但顏色判斷易受主觀因素的影響，缺乏客觀評價標準，且顏色的界定過于模糊，不利于飲片的規范化生產和質量評價;加之干姜飲片的炮制程度與其成分、顏色的相關性尚未有文獻報道，因此需要建立一種科學、有效的適用于評價干姜及其不同炮制品的客觀量化方法。

色彩色差計是通過模擬人眼對顏色的判斷，得到樣品顏色的3個刺激值X、Y和Z[7]，再根據國際照明委員會Lab顏色空間原理計算得出色差值明度（L*）、紅綠色軸分量（a*）、黃藍色軸分量（b*）（其中，“+a*”表示紅色，“-a*”表示綠色;“+b*”表示黃色，“-b*”表示藍色）[8]，最后通過L*、a*、b*將顏色準確量化。近年來，色彩色差計已在食品、醫藥等領域廣泛應用，如石典花等[9]通過色彩色差計驗證了傳統方法鑒別丹參“色紅者佳”的科學性;黃學思等[10]通過色彩色差計測定不同炮制程度的檳榔顏色，發現該方法能用于判別中藥炮制的“火候”。基于此，本研究采用色彩色差計對干姜、炮姜和姜炭的顏色進行客觀、數字化處理，對傳統的顏色指標進行客觀量化，并分析其與主要活性成分含量的相關性，旨在為干姜及其炮制品的鑒別和質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，包括電光二極陣列管檢測器、色譜工作站（美國Agilent公司）;CR-410型色彩色差計，配備CR-A50型粉末測試盒（日本Konica Minolta公司）;YB-2500A型高速多功能粉碎機（永康市速鋒工貿有限公司）;CPA225D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;KQ-300DE型超聲波清洗器（上海凌科實業發展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

姜酮對照品（批號：131010，純度：≥98%）、6-姜烯酚對照品（批號：130912，純度：≥98%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司;6-姜酚對照品（批號：130827，純度：≥98%）、8-姜酚對照品（批號：140422，純度：≥98%）、10-姜酚對照品（批號：140520，純度：≥98%）均購自南通飛宇生物科技有限公司;二乙酰氧基-6-姜二醇對照品（本課題組自制，純度：≥98%）[11];乙腈、乙酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

16批干姜飲片（編號：GJ1～GJ16）由廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定，均為姜科植物姜（Z. officinale Rosc.）的干燥根莖。樣品采集后密封避光存放在干燥器中，并于2年內完成試驗，樣品信息來源見表1。

2 方法與結果

2.1 干姜及其炮制品的制備

干姜：除去雜質，略泡，洗凈，潤透，切厚片，干燥，按2015年版《中國藥典》（四部）“0213炮制通則”[12]炮制。炮姜：取干姜用砂燙至鼓起，表面呈棕褐色，即得，共制備16批（編號：PJ1～PJ16）。姜炭：取干姜炒至表面黑色、內部棕褐色，即得，共制備16批（編號：JT1～JT16）。

2.2 含量測定方法的建立

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚對照品各適量，分別加甲醇溶解，制成上述6種成分質量濃度分別為0.706、0.580、0.974、0.528、0.410、0.468 mg/mL的單一對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液300、1 400、400、800、1 200、1 200 μL，加甲醇稀釋并定容于5 mL量瓶，混合均勻，制得6種成分質量濃度分別為42.36、162.4、77.92、84.48、98.40、112.32 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取干姜、炮姜、姜炭樣品粉末（過80目篩）各0.3 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz，下同）提取40 min，用甲醇補足減失的質量，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得3種供試品溶液。

2.2.3 空白對照溶液的制備 不加藥材樣品，其余按“2.2.2”項下方法“加甲醇10 mL……經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液”操作，即得。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：UltimateTM XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A→25%A;10～20 min，25%A→35%A;20～55 min，35%A→75%A;55～90 min，75%A→90%A;90～100 min，90%A→100%A）;檢測波長：280 nm;柱溫：30 ℃;流速：0.6 mL/min;進樣量：10 μL。

2.2.5 系統適用性試驗 精密量取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μL，按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果，各成分的分離度均大于1.5，理論板數以姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇和10-姜酚峰計均大于5 000，空白對照對測定無干擾。

2.2.6 線性關系考察 精密量取姜酮對照品溶液7.5、37.5、75、150、300 μL，6-姜酚對照品溶液35、175、350、700、1400 μL，8-姜酚對照品溶液10、50、100、200、400 μL，6-姜烯酚對照品溶液20、100、200、400、800 μL，二乙酰氧基-6-姜二醇和10-姜酚對照品溶液30、150、300、600、1 200 μL，用甲醇稀釋并定容于2 mL量瓶中，得系列質量濃度的線性工作溶液，按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表2。

2.2.7 定量限與檢測限考察 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，按“2.2.4”項色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限和檢測限。結果，姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚的定量限分別為7.46、13.68、14.37、16.62、17.03、17.99 ng，檢測限分別為2.24、4.11、4.31、4.99、5.11、5.40 ng。

2.2.8 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.4”項下色譜條件于同日內連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚峰面積的RSD 分別為1.92%、1.66%、1.98%、1.55%、1.35%、1.96%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩定性試驗 精密量取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：PJ10）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時，按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚峰面積的RSD 分別為0.27%、0.30%、0.64%、0.35%、0.41%、0.31%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.10 重復性試驗 精密稱取樣品粉末（編號：PJ10）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中6種成分的含量。結果，姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚的平均含量分別為0.20、2.77、0.87、1.60、1.45、1.61 mg/g，RSD分別為2.07%、1.83%、2.05%、2.13%、2.42%、1.56%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（編號：PJ10），每份約0.15 g，共9份，按待測成分含量的50%、100%、150%加入“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚的平均加樣回收率分別為101.34%、102.14%、101.22%，103.12%、103.74%、103.54%，103.06%、98.55%、99.43%，99.36%、103.51%、101.21%，100.85%、99.42%、99.60%，100.39%、97.69%、103.84%（RSD均小于3%，n=3）。

2.3 色澤測定方法的建立

2.3.1 測定方法與條件 分別取干姜、炮姜、姜炭樣品適量，粉碎后過80目篩，混合均勻，將樣品粉末置于色彩色差計中，測定樣品粉末顏色，每樣品平行測定3次，取平均值。色彩色差計測定條件為光源D65，標準觀察角度2°，照明口徑50 mm。經白板校準，以L*=100、a*=0、b*=0為參照校正色[13]，測得各樣品的L*、a*、b*。

2.3.2 精密度考察 取樣品（編號：GJ6）粉末適量，置于色彩色差計中，在同日內按“2.3.1”項下測定條件連續測定5次。結果，L*、a*、b*的RSD分別為0.01%、0.41%、0.05%（n=5），表明本方法精密度良好。

2.3.3 樣品穩定性考察 取樣品（編號：GJ6）粉末適量，置于色彩色差計中，按“2.3.1”項下測定條件連續5天在同一時刻測定樣品色差值。結果，L*、a*、b*的RSD分別為0.94%、1.96%、1.76%（n=5），表明樣品穩定性良好。

2.3.4 不同光照強度的穩定性考察 取樣品（編號：GJ6）粉末適量，置于色彩色差計中，按“2.3.1”項下測定條件分別于同日內10：30、13：00、15：30、17：30、20：00時連續測定樣品色差值，共5次。結果，L*、a*、b*的RSD分別為0.54%、1.44%、0.95%（n=5），表明不同光照強度對試驗結果穩定性影響較小。

2.4 樣品含量及色澤的測定

精密稱取48批樣品粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中6種成分的含量。另精密稱取48批樣品粉末適量，置于色彩色差計中，按“2.3.1”項下測定條件測定樣品色差值。每樣品平行操作3次，結果見表3。

2.5 秩和檢驗分析

采用SPSS 24.0軟件對數據進行統計分析。由于部分試驗數據不符合正態分布且方差不齊，故采用秩和檢驗分析。經獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗，得干姜、炮姜、姜炭L*、a*、b*的χ 2分別為41.805、35.639、41.796（P均小于0.01），而在獨立樣本中位數檢驗中的χ 2分別為32.000、28.500、32.000（P均小于0.01），均拒絕假設H0（數據無差異），接受假設H1（數據有差異），表明干姜、炮姜、姜炭顏色有顯著性差異。

2.6 判別分析

將樣本按炮制類型分為3類（1類為干姜、2類為炮姜、3類為姜炭），以48批樣品作為訓練集，采用SPSS 24.0軟件建立以L*、a*、b*為變量的干姜、炮姜、姜炭的判別函數，再用訓練集回代驗證。結果，在判別函數中，L*、a*、b*均有統計學意義（P<0.01），其λ值分別為0.019、0.134、0.024（λ值表示組間差異，范圍為0～1，其值越小表示組間差異越大[14]）。由于L*的λ值最接近0，表明組間差異最顯著，故認為L*在判別中貢獻率最大。根據Wilks Lambda檢驗結果，建立2個典則判別函數，λ值分別為0.002、0.136，判別函數有統計學意義（P<0.01），得到標準化典則判別函數1=0.462×L*-0.321×a*+0.782×b*，函數2=0.231×L*+1.190×a*-0.172×b*;非標準化典則判別函數分別為函數1=0.417×L*-0.691×a*+0.994×b*-24.467，函數2=0.208×L*+2.562×a*-0.219×b*-17.769，詳見圖2（組質心表示數據分布的平均位置）。由圖2可知，干姜、炮姜、姜炭的色澤具有顯著區別。結果，16批干姜為1類，16批炮姜為2類，16批姜炭為3類，判別準確率為100%，提示該模型具有理想的判別效果。

2.7 相關性分析

2.7.1 色澤與不同炮制程度的相關性 采用SPSS 24.0軟件對干姜、炮姜、姜炭與其L*、a*、b*進行秩相關分析。Kedalls tau_b檢驗結果顯示，L*、a*、b*與干姜、炮姜、姜炭的相關系數分別為-0.826（P<0.01）、0.176（P>0.05）、-0.825（P<0.01）。Spearmans rho檢驗結果顯示，L*、a*、b*與干姜、炮姜、姜炭的相關系數分別為-0.943（P<0.01）、0.302（P<0.05）、-0.943（P<0.01）。這提示，L*、b*與干姜不同炮制程度呈極顯著負相關，a*與炮制程度相關性不強（P<0.05表示顯著相關，P<0.01表示極顯著相關，下同）。

2.7.2 色澤與含量的相關性 采用SPSS 24.0軟件對干姜、炮姜、姜炭中的6種成分含量與其L*、a*、b*進行秩相關分析。Kendalls tau_b檢驗和Spearmans rho檢驗結果均顯示，干姜炮制前后，L*、b*與姜酮含量呈極顯著負相關，與其余5種成分呈極顯著正相關;a*與姜酮呈極顯著正相關，與其余5種成分無相關性，詳見表4[“#”表示在0.05水平（雙側）上顯著相關;“##”表示在0.01水平（雙側）上顯著相關]。

2.7.3 干姜、炮姜、姜炭與含量的相關性 將干姜、炮姜、姜炭與其所含的6種成分含量進行秩相關分析。結果顯示，Kendalls tau_b檢驗的相關系數分別為0.686、 -0.680、-0.630、-0.462、-0.679、-0.684，P均小于0.01;Spearmans rho檢驗的相關系數分別為0.805、? ? ?-0.818、-0.773、-0.631、-0.816、-0.819，P均小于0.01。這提示，干姜、炮姜、姜炭與姜酮含量呈極顯著正相關，與其余5種成分含量呈極顯著負相關。

3 討論

在傳統的中藥鑒定方法中，其顏色的定義和描述大多依賴于研究者的主觀經驗和感受，結果缺乏客觀性與準確性，加之中藥自身的復雜性，主觀判斷會影響藥材和飲片的質量評價結果[15]。現代色彩分析技術的發展可將人對顏色的主觀判斷進行客觀量化，保證了顏色判斷的準確性、穩定性和重復性，現已廣泛應用于中藥的質量評價[16]。目前，干姜及其不同炮制品的鑒別主要根據傳統的性狀、顏色進行鑒定，也有文獻報道了多成分含量測定、指紋圖譜等內容[17-18]，但顏色的客觀量化標準及與其內在成分的相關性分析尚未有報道。因此，有必要對干姜炮制前后顏色進行量化，分析顏色與成分之間的相關性，為評價干姜飲片質量提供依據。

本研究通過測定干姜及其炮制品中6種活性成分的含量，發現這6種成分的含量均發生了一定變化。其中，姜酮為炮制后新生成的化合物，而6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚的含量均有所下降。本研究通過色彩色差計測定樣品的色差值，建立了干姜不同炮制程度的判別模型。結果顯示，該判別模型的判別準確率為100%，提示該模型預測效果準確，可實現對干姜及其炮制品快速、準確的鑒別;同時將干姜及其炮制品的色差值與含有的6種成分含量進行相關性分析，發現隨著炮制程度的加深，a*增加，L*、b*降低，姜酮含量升高，6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚含量降低，干姜、炮姜、姜炭與姜酮含量呈極顯著正相關，與其他5種成分含量呈極顯著負相關，故推測干姜炮制前后顏色的變化與其化學成分含量的變化有關。

綜上所述，干姜及其炮制品的色差值與其化學成分含量相關，即隨炮制程度的加重，其a*增加，L*、b*降低;姜酮含量升高，6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、二乙酰氧基-6-姜二醇、10-姜酚含量降低。色彩色差計法操作簡單、檢測時間短，能間接反映飲片的內在質量，為建立干姜及其炮制品新的質量評價方法提供了參考，可推廣至干姜的質量評價體系和干姜炮制過程的在線檢測中。

參考文獻

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（收稿日期：2019-10-15 修回日期：2020-03-31）

（編輯：陳 宏）