褪黑素浸種對大豆種子萌發過程中干旱脅迫的緩解效應

秦 彬，張明聰，何松榆，張春宇，王明瑤，金喜軍，王孟雪，張玉先，胡國華

(黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江大慶163319)

大豆是我國重要的經濟作物，而干旱是限制大豆籽粒萌發的重要限制因素之一。因此，提高大豆抗旱能力，對于擴大我國大豆種植面積和實現大豆增產穩產具有重要的實際意義。干旱脅迫會引發植物生理代謝功能紊亂，導致植物體內的活性氧含量增加，引起細胞膜脂過氧化以及膜通透性發生改變，從而影響植物正常的生長發育［1-3］。如種子萌發階段干旱會抑制大豆種子發芽和大豆根系的發育，從而對大豆營養生長造成不利影響［4］。

現階段植物生長調節劑被普遍應用于提高作物對逆境的抵抗能力上。褪黑素(melatonin，MT)是一類廣泛存在于動植物體內的吲哚類激素，其在植物中具有多種功能，包括調節植物生長發育，提高植物對多種逆境的抗性［5-6］。在小麥的研究中發現，外源褪黑素能提高干旱脅迫下小麥種子的發芽勢和發芽率，增強幼苗根系吸水能力［7］。干旱脅迫也會使植株體內滲透調節物質增加以緩解逆境條件對植株造成的損傷。研究表明［8］，水分脅迫下施用褪黑素處理可顯著增加黃瓜萌發期體內的可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調節物質的含量，降低膜損傷程度。膜脂過氧化損傷會使細胞內核酸和蛋白質等代謝活性物質失衡，進而導致植物生長發育受阻。而一般認為褪黑素是通過提高抗氧化酶活性(SOD、POD)來緩解逆境對植物造成膜脂過氧化損傷。在紫蘇幼苗的研究中發現［9］，當受到干旱脅迫時外源褪黑素可增強根系中的抗氧化酶活性，降低丙二醛(MDA)含量，有效增強了幼苗的抗旱性。另有研究表明［10］外源褪黑素可以通過降低植物體內活性氧(ROS)含量，緩解因干旱脅迫造成的植物生物膜損傷，保護細胞結構，提高細胞內滲透調節物質含量，從而增強植物的抗旱能力。

干旱脅迫不利于作物的生長和繁殖，近些年褪黑素對逆境脅迫下植物生長發育調節作用的研究越來越被關注，而褪黑素對干旱脅迫下大豆萌發期根系的生長發育及生理特性影響鮮有報道。本文通過研究干旱脅迫下不同濃度的褪黑素浸種對大豆萌發期生長發育以及生理生化的影響，篩選出適宜調節干旱脅迫的最佳施用濃度，為深入探索褪黑素調節干旱脅迫的機制提供參考，為后續試驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗開始于2018年5月，在黑龍江省大慶市黑龍江八一農墾大學大豆研究室進行。供試材料為干旱敏感型大豆品種綏農26［11］，由黑龍江省農業科學院大慶分院提供;褪黑素由國家雜糧工程技術研究中心提供。

選取健康飽滿的大豆種子在5%NaClO溶液中消毒10 min后用蒸餾水沖洗5次并恢復至種子初始含水量。配制不同濃度褪黑素溶液(0、100、300、500、800μmol·L-1)浸種12 h后將種子晾干。通過前期預試驗確定PEG(6000)6%濃度對大豆萌發期根系有較明顯的抑制作用。共設置6個處理，分別包括蒸餾水處理種子(CK)、6%PEG模擬干旱脅迫處理+蒸餾水處理種子(D)、6%PEG+100μmol·L-1褪黑素處理種子(M100+D)、6%PEG+300μmol·L-1褪黑素處理種子(M300+D)、6%PEG+500μmol·L-1褪黑素處理種子(M500+D)、6%PEG+800 μmol·L-1褪黑素處理種子(M800+D)。根據不同處理將10粒大小均勻一致的預處理種子放于鋪有3層濾紙的培養皿(直徑9 cm)內，置床起記為第0天。將其放入培養箱中 25℃條件下恒溫培養，每2 d更換一次濾紙，稱重法補水，每天定時稱重并向培養皿內加入處理液到初始重量，保持處理液濃度不變。每天觀察發芽情況，調查種子發芽數，當胚根突破種皮，長度為種長一半時計為發芽種子。3 d后測定發芽勢、7d后測定發芽率。每個處理設3次重復，培養時間為7 d。

1.2 測定項目與方法

培養3 d后統計種子的發芽勢，7 d后統計種子的發芽率。

發芽率=培養7 d后供試種子的發芽數/供試種子數×100%;

發芽勢=培養3 d后供試種子的發芽數/供試種子數×100%。

式中，D為從種子置床起算的天數，n為相應各天的發芽粒數。

式中，Gt指在時間t日內的發芽數，Dt為相應的發芽天數。

式中，S為幼苗鮮重。

萌發7 d后，對每個處理的根系進行掃描，并用根系形態學和結構分析應用系統winRHIZO分析根的形態指標。用電子天平稱量鮮重，用 DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司生產)105℃殺青1 h后80℃烘干至恒重，用電子天平稱量干重。

每個處理混合取樣，并于-80℃保存樣品，測定樣品的酶活性和其他生理指標。游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法測定［12］;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定［13］;可溶性糖含量的測定參照蒽酮比色法［14］;丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定［15］。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)、過氧化氫酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)參照Zou等［16］方法測定;電導率采用電導率儀測定;過氧化氫(H2O2)含量按照高洪波等［17］的方法進行測定。

1.3 數據分析

數據處理用SPSS軟件的Duncan’s多重比對法對數據進行統計分析，用Origin軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 褪黑素浸種對干旱脅迫下大豆種子萌發的影響

由表1可知，對照組(CK)的發芽率與發芽勢均為96.7%，與對照組(CK)相比處理D發芽率和發芽勢均顯著降低，降幅均為70%，說明干旱脅迫下種子的萌發受到明顯抑制。不同濃度褪黑素處理大豆種子的發芽率和發芽勢與處理D相比均有不同程度的上升，說明褪黑素可有效緩解干旱脅迫對大豆種子萌發的抑制，其中處理M500+D效果最為顯著，發芽率和發芽勢分別達到了96.00%和93.00%。平均發芽速度、活力指數和種子發芽指數的變化趨勢與發芽率和發芽勢的變化趨勢一致。處理D的種子活力指數和發芽指數均明顯低于對照組(CK)，與CK相比降低了105.86%和38.74%。然而處理M100+D、M300+D、M500+D的平均發芽速度、活力指數和種子發芽指數與處理D相比均有明顯的升高，其中處理M500+D的平均發芽速度、種子活力指數和發芽指數與處理D相比提高了4.00%、41.86%和22.88%。但是隨著褪黑素濃度的升高，這種促進作用逐漸減弱，處理M800+D種子的平均發芽速度、活力指數均顯著低于M500+D，且發芽勢、發芽率、發芽指數也有所降低，說明褪黑素浸種對緩解干旱脅迫作用有一定效果，但若濃度過高則會抑制種子萌發。

2.2 褪黑素浸種對干旱脅迫下大豆萌發期根系指標及生物量的影響

由表2可知，與對照組(CK)相比處理D的根長、表面積、根體積和直徑分別降低了 30.29%、32.09%、23.72%和4.76%，說明處理D種子的根系生長受到了明顯的抑制。與處理D相比其他各處理的根系指標均有不同程度的上升，其中處理M500+D效果最為顯著，分別上升了13.67%、11.52%、18.41%和34.97%。干鮮重的變化趨勢與根系指標的變化趨勢大致相同。其中干重以處理M300+D最高，而鮮重以處理M500+D為最大值，與處理D相比提高了10.64%和22.94%。結果表明，褪黑素浸種在一定程度上能夠有效地緩解干旱脅迫對大豆根系生長的抑制和生物量的累積。

2.3 褪黑素浸種對干旱脅迫下大豆萌發期根系抗氧化酶的影響

由圖1所示，不同濃度的褪黑素浸種對抗氧化酶活性的影響不同。與對照組(CK)相比處理D的SOD、POD、CAT、APX活性顯著提升，而干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理的抗氧化酶活性與處理D相比呈現先上升后下降的趨勢，其中處理MT500效果最為顯著，分別上升了37.61%、40.10%、12.96%和28.31%。結果表明，褪黑素浸種可以提高干旱脅迫下大豆萌發期根系中抗氧化酶活性，有效緩解了干旱脅迫對大豆造成的損傷，但濃度過大亦會產生抑制的情況。

表1 褪黑素浸種對干旱脅迫下大豆萌發的影響Table 1 Effects of melatonin soaking on germination of soybean under drought stress

表2 褪黑素浸種對干旱脅迫下大豆萌發期根系指標及生物量的影響Table 2 Effects of melatonin soaking on root index and biomass of soybean at germination stage under drought stress

圖1 褪黑素浸種對干旱脅迫下大豆萌發期抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of melatonin soaking on antioxidant enzyme activities during soybean germination under drought stress

2.4 褪黑素浸種對干旱脅迫下大豆萌發期根系膜脂過氧化物質與滲透調節物質的影響

由圖2可知，干旱脅迫處理可以導致大豆根系體內的H2O2大量積聚，對大豆根系造成了膜脂過氧化損傷，MDA、H2O2含量和電導率的積累可作為膜脂過氧化程度的指標之一。與對照組(CK)相比處理D的MDA、H2O2含量和電導率顯著升高，增幅為53.40%、83.33%和60.60%。而不同濃度褪黑素處理的膜脂過氧化物質與處理D相比均有不同程度的下降，其中處理MT500效果最為顯著，降幅為31.53%、16.69%和32.50%。

滲透調節物質的變化趨勢與其他指標不同，處理D中的滲透調節物質脯氨酸、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量均明顯高于對照組(CK)，與CK相比上升了37.13%、17.42%和52.25%。而處理M100+D、M300+D、M500+D的滲透調節物質含量與處理D相比均有明顯升高，其中以處理M300+D效果最好，M500+D其次。處理M300+D相比處理D的脯氨酸、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量上升了27.30%、28.56%和32.49%。以上結果表明，褪黑素浸種可以抑制干旱脅迫下大豆根系產生的膜質過氧化物質并增加滲透調節物質的含量，減少膜系統所受到的外界環境損傷。

3 討 論

干旱脅迫會引發大豆種子生理代謝功能紊亂，從而抑制大豆種子的萌發，莫金剛等［18］研究表明，干旱脅迫對大豆種子的發芽率、發芽勢、平均發芽速度、活力指數和發芽指數有較強的抑制作用。本研究發現，干旱脅迫下大豆種子萌發受到明顯抑制，主要表現為發芽率和發芽勢顯著下降，平均發芽速度減緩，活力指數和發芽指數明顯降低。而褪黑素浸種可有效緩解干旱脅迫對大豆種子萌發產生的不利影響，這與 Liu 等［19］和嚴加坤等［20］研究逆境脅迫下褪黑素對水稻和玉米萌發情況的結果一致。

圖2 褪黑素浸種對干旱脅迫下大豆萌發期滲透調節物質的影響Fig.2 Effects of melatonin soaking on osmotic regulation substances during soybean germination under drought stress

根系是大豆吸收水分和養分的主要器官，其生長情況對大豆發育產生重要影響。本試驗通過褪黑素浸種對大豆進行發芽培養，發現干旱脅迫嚴重抑制大豆萌發期根系的生長。這與前人［18］對干旱脅迫下大豆生長發育情況的研究結果相同。而干旱脅迫下經過褪黑素浸種處理的大豆根長、根體積與根表面積相較于處理D來說并不顯著，但根直徑與干重不僅顯著高于處理 D，甚至超過了對照(CK)。關于褪黑素可以促進根生長的研究有很多，Cui等［21］研究發現在干旱脅迫下褪黑素可以促進小麥種子生根，促進根系生長發育。低濃度褪黑素還可以促進甜櫻桃不定根的再生［22］。由此可推斷褪黑素在干旱脅迫下可以通過增加大豆根直徑來提升干物質累積，而不是通過增加根的長度來提高根重。褪黑素浸種處理可以促進大豆萌發期根系發育，并可以在干旱脅迫下提高大豆萌發期根系的干物質累積，從而提高大豆抵御干旱的能力，這與劉月等［6］認為鹽害脅迫下褪黑素通過提升大豆根直徑來增加根重的研究結果一致。

干旱脅迫打破了活性氧在植物體內的動態平衡，引起了植物體內細胞氧化損傷［23］。褪黑素可通過上調編碼抗氧化酶基因的轉錄水平來激活抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)活性來清除植物體內過量的MDA與H2O2，緩解干旱脅迫帶來的氧化損傷［24-27］。以往的研究表明［28］，外源褪黑素能夠顯著提高逆境脅迫下植物體內抗氧化酶活性，從而提高植物清除活性氧的能力。本研究發現，干旱脅迫下大豆萌發期根系內電導率、MDA、H2O2含量快速上升，說明干旱脅迫下活性氧大量累積，細胞膜遭到嚴重破壞。干旱脅迫同時也提高了大豆萌發期根系中抗氧化酶活性，而經過褪黑素100～500μmol·L-1浸種后進一步增強了大豆萌發期根系中抗氧化酶的活性，減少了干旱脅迫下MDA和H2O2的含量。這說明在干旱脅迫下經過褪黑素浸種可以激活大豆萌發期根系中抗氧化酶的活性，有效清除過量的H2O2，使得MDA含量與電導率維持在較低水平，緩解了干旱脅迫誘導的膜脂過氧化給大豆根系帶來的損傷。適宜的褪黑素濃度有利于清除干旱脅迫誘導的 ROS，穩定膜結構，而過量的褪黑素則破壞了蛋白質的氧化平衡態［24］，所以由此推測高濃度褪黑素可能會干擾抗氧化酶的正常運作從而加重了細胞過氧化的損傷。

滲透調節是植物在干旱脅迫下降低滲透勢、抵抗逆境脅迫的一種重要方式［29-30］。脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白作為滲透調節物質，其含量的高低能夠衡量植物體對逆境的適應能力。前人研究表明［31］，褪黑素可增加番茄體內脯氨酸含量從而緩解干旱脅迫造成的損傷;另有研究發現［6］，褪黑素可以促進大豆幼苗細胞中可溶性糖的合成，平衡液泡里鹽分脅迫，增加其抗逆性。本研究結果表明，大豆萌發期根系的游離脯氨酸、可溶性蛋白與可溶性糖含量在干旱脅迫下均有所增加，而經過褪黑素浸種的種子在干旱脅迫下其根系中滲透調節物質含量進一步提升，說明褪黑素浸種可以促進大豆細胞中有機溶質的合成，增加滲透調節物質的含量，降低細胞滲透勢，維持了植物體內的滲透平衡，從而保證了細胞膜結構的完整，提高植物對干旱脅迫的適應能力。本研究結果與李鵬輝等［32］的研究結果一致。

4 結論

綜上所述，干旱脅迫會導致活性氧的大量累積，致使細胞膜脂過氧化，破壞了細胞的滲透平衡從而抑制了大豆種子的萌發，影響大豆的正常生長發育。而褪黑素浸種顯著提高了干旱脅迫下大豆種子的發芽能力，促進了根系發育，激活了大豆體內抗氧化酶活性，清除過量的MDA與H2O2，降低根系細胞的膜脂損傷，提高了大豆體內滲透調節物質含量，緩解了由干旱脅迫導致的細胞滲透體系失衡所帶來的損傷。本試驗結果表明500μmol·L-1褪黑素浸種對于緩解干旱脅迫下大豆種子萌發效果最顯著。