水稻土中鐵氧化物對產甲烷古菌群落結構的影響

徐健鑫,扆幸運,李曉明,丁龍君,朱永官,4,*

1 中國科學院生態環境研究中心土壤環境研究室, 北京 100085 2 中國科學院大學中丹學院, 北京 100049 3 中國科學院大學, 北京 100049 4 中國科學院城市環境研究所, 廈門 361021

甲烷(CH4)是繼二氧化碳(CO2)之后第二大溫室氣體,其較強的紅外線吸收能力使其單分子增溫的潛力是CO2的20—30倍[1- 2]。目前全球每年CH4排放量約5×108—6×108t,其中約70%來源于微生物作用[3]。產甲烷菌是其中最大的貢獻者。產甲烷菌是地球上最古老的生命形式之一[4],廣泛分布于稻田、海洋沉積物、厭氧消化器等厭氧環境中[5- 7],是復雜有機質厭氧降解的重要推動者[8]。根據碳源差異,產甲烷菌的能量代謝方式可分為：以H2或甲酸為電子供體還原CO2、乙酸發酵及甲基營養型等三種[9]。

稻田是我國最重要的人工濕地生態系統,也是CH4排放的人為源之一[10]。每年來源于稻田的CH4排放量約2×107—1.2×108t,中國位于世界首位[11]。氧化鐵是稻田土中最豐富的氧化物。多形態、高化學活性的氧化鐵在周期性干濕交替的稻田土壤中表現出活躍的價態變化,影響著其他營養元素的生物地球化學循環[12-13]。有研究報道,由微生物介導的鐵還原直接影響著甲烷合成等其他代謝途徑[14]。Jackel等研究發現向水稻土中添加15或30 g/kg水鐵礦時,甲烷釋放的抑制效率分別可達43%和84%[15]；Peng等向不同植區水稻土中添加葡萄糖后發現土壤中Fe(II)的產生量與CH4的釋放量顯著相關,并提出以Fe(II)/[Fe(II)+Fe(III)]預估CH4排放量的模型[16]。然而,目前關于鐵氧化物對產甲烷菌群落結構的影響報道較少。

本研究通過泥漿厭氧培養,以甲酸鹽為產甲烷底物,水鐵礦為唯一電子受體,探究添加鐵氧化物(鐵還原)對產甲烷菌的群落組成的影響。本實驗將為探究水稻土中鐵還原與碳代謝間耦合的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 水鐵礦的制備

水鐵礦(Fe5HO8·H2O[12])的制備方法參照Schwertmann和Cornell[17]進行了適當修改。用去離子水配制0.4 mol/L FeCl3溶液,并用1.0 mol/L NaOH溶液將pH調至7.0。然后用10倍體積的去離子水洗滌、離心沉淀(5000 r/min,10 min),直到上清液中Cl-濃度小于1 mmol/L。將洗好的沉淀冷凍干燥,研磨過篩(0.07 mm),室溫保存。

1.2 無菌缺氧去離子水的制備

向去離子水中添加微量刃天青作為氧化還原指示劑,將無菌針頭插入液面以下并通入高純N2,加熱并維持沸騰狀態30 min,以去除去離子水中的溶解氧,此時液體成粉紫色；稍冷,加入0.3 g/L L-半胱氨酸,持續微熱并通入高純N2至液體變為無色；迅速封裝,高壓滅菌(121℃,20 min),冷卻待用。

1.3 泥漿厭氧培養

土壤樣品采自湖南省桃源縣長期施肥實驗站(28°21′N,116°92′E)。采集土壤表層0—20 cm,并去除樣品中細小的沙石和根系,放入無菌自封袋中密封,冷藏運回實驗室。將樣品風干過篩(1 mm),充分混勻。

由于微生物對甲酸鹽的大量消耗,在10 d培養期間每天向體系中按7 μmol/g的濃度補充甲酸鹽,且培養結束時(記為第10天)體系中幾乎沒有甲酸鹽剩余。

1.4 泥漿DNA提取及16S rRNA基因測序

取培養第0、10天的泥漿0.5 g(干土計),用FastDNA Spin Kit for Soil(MP bio,CA,USA)試劑盒提取泥漿 DNA。選擇16S rRNA基因的V4高變區(ArBa515f_Arch806r)進行擴增,20 μL PCR體系包括：4 μL 5×FastPfu Buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,前、后引物各0.8 μL,0.4 μL FastPfu Polymerase,0.2 μL BSA和2 μL DNA,剩余用無菌水補齊。PCR反應條件如表1。樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

表1 PCR反應引物和反應條件

1.5 數據分析

初始數據分析采用Excel 2016進行,采用SPSS(20.0,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件進行顯著性分析(one-way ANOVA)。計算香農指數和辛普森指數描述古菌群落的α多樣性,基于Weighted normalized Unifrac距離算法進行主坐標分析。將相對豐度發生顯著差異的操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)序列與NCBI數據庫中序列比對,利用MEGA的Neighbor-Joining法構建系統發育樹,檢驗方法為bootstrap,重復1000次。

圖1 培養結束前、后微生物群落組成 Fig.1 Barplot of microbial community structure in CK and Fh treatments at day 0 and 10 CK：對照處理 Control；Fh：水鐵礦處理 Ferrihydrite.誤差線為三組重復的標準偏差,上方的小寫字母為不同處理培養前后的顯著性差異(P<0.05)

2 結果

2.1 古菌群落多樣性變化分析

基于16S rRNA基因測序結果,我們發現微生物群落大多由細菌構成,古菌占比不足30%,且培養結束后僅CK處理中古菌所占比例顯著(P<0.05)升高,Fh處理中無顯著變化(圖1)。

進一步從OTU水平上分析CK和Fh兩組處理中古菌群落組成的多樣性,發現兩組處理中香農指數均極顯著下降(P<0.001),而辛普森指數極顯著上升(P<0.001,圖2)。這說明添加甲酸鹽處理10天后,不僅降低了體系中古菌群落的物種多樣性,同時降低了OTU水平上古菌群落的均一性。另外,發現與CK相比,添加水鐵礦盡管可以降低微生物群落結構中古菌的占比,但對古菌群落組成的多樣性沒明顯影響?；赪eighted normalized Unifrac算法的主坐標分析(圖3)表明經10天厭氧培養,CK和Fh處理的古菌群落結構均與培養前明顯不同,且兩者培養后的古菌群落組成也具有顯著差異；主坐標解釋了總方差的82.84%。

圖2 培養前、后泥漿中古菌群落結構的多樣性指數(*** P<0.001)Fig.2 Barplot of Shannon index and Simpson index of archaea in CK and Fh treatments at day 0 and 10

圖3 培養前、后泥漿中古菌OTU水平的主坐標分析圖Fig.3 Principal co-ordinate analysis plot for archaea community structure in CK and Fh treatments at OTU level

2.2 OTUs水平上古菌群落結構變化分析

為進一步分析添加甲酸鹽和水鐵礦對古菌群落的影響,我們對比不同處理中培養前后每個OTU在體系中的相對豐度,最終發現OTU 2056,OTU 911,OTU 3870,OTU 2032,OTU 1970,OTU 2456,OTU 1931和OTU 895等8個培養后相對豐度發生顯著(P<0.05)變化的OTU(圖4)。其中,僅OTU 2056和OTU 911相對豐度升高,分別占CK和Fh處理古菌群落的80%和76%；根據系統發育分析,兩者均與Methanobacterium具有較近的親緣關系。OTU 2032和OTU 2456僅在CK處理中相對豐度下降,它們與Methanosarcina具有較高的相似性；而OTU 1931和OTU 895相對豐度變化僅發生于Fh處理中,與Methanocellales較為相似。

圖4 厭氧培養10天后CK處理和Fh處理中相對豐度顯著變化的OTUs及其系統發育分析(*P<0.05,*** P<0.01,*** P<0.001)Fig.4 Phylogenetic tree of OTUs whose relative abundance change significantly after 10-day anaerobic incubations in control and Fh treatment

圖5 厭氧培養10天后Fh和CK處理中OTU差異的韋恩圖 Fig.5 Venn diagram of OTU difference between CK and Fh after 10-day incubations

3 討論

甲酸是生物大分子降解過程中除乙酸外又一重要的中間代謝產物[18],也是大多H2營養型產甲烷菌可以利用的一種底物[10]。從能量角度上,除直接還原CO2/CO途徑以外,以甲酸鹽為電子供體是微生物最容易產甲烷的途徑[10]。本研究結果顯示,以甲酸鹽為底物進行泥漿厭氧培養后,體系的古菌群落結構從OTU水平上發生了明顯的改變(圖3),其物種多樣性和群落結構的均一性均顯著降低(P<0.05,圖2)。造成這一結果的原因是添加甲酸鹽刺激了OTU 2056和OTU 911的顯著富集(P<0.001,圖4),使其成為古菌中的主要優勢種,從而降低了其他如Methanosarcina、Methanocellales和Crenarchaeote等類似古菌的相對豐度。系統發育分析結果顯示這兩個OTU均與Methanobacteriumbryantii有較高的相似性。M.bryantii在系統發育上與M.formicicum相似,兩者都能利用甲酸鹽產H2和CH4[19]。Bryant等最早發現M.bryantii可以利用S菌株氧化乙醇的產物H2合成甲烷,降低了H2累積對S菌株生長的抑制,從而實現了兩者的互營共生[20]。之后,Guyot等也發現M.bryantii可以利用甲酸,與DesulfovibriovulgarisJJ共生產甲烷[21]。我們的體系中是否也存在著這種互營關系有待進一步確認。

水稻土中存在著豐富的鐵氧化物,在周期性灌溉-排水的管理模式下,鐵也發生了活躍的價態變化,并影響著其他生命活動[13,22]。結果發現,添加水鐵礦培養后,古菌在全部微生物群落中的占比沒有發生明顯變化,顯著低于CK處理(P<0.05)。這與早期的研究報道一致。微生物(細菌)介導的鐵還原與產甲烷過程競爭電子和底物,因此與不發生鐵還原相比,產甲烷菌的生長會受到抑制[5]。但我們進一步發現,CK和Fh處理培養前后古菌群落的α多樣性沒有差異,且培養后兩個處理組中的優勢種均為OTU 2056和OTU 911,占比也相似。這說明添加水鐵礦對古菌群落的遷移沒有主導作用。培養后83% OTUs同時存在于CK和Fh處理中(圖5),也驗證了這一結論。

4 結論

添加甲酸鹽可以有效地富集土壤中Methanobacteriumbryantii的類似微生物；添加鐵氧化物只能從總體上減少古菌占微生物總體的比重,但對古菌群落的多樣性和均一度以及顯著富集的菌株類型沒有影響。因此,在有機物的厭氧降解過程中,鐵氧化物可能只通過抑制產甲烷菌的生長減少甲烷的釋放,而對主要發揮功能的菌株不具選擇作用。