1型鴨疫里默氏菌的分離鑒定和藥敏試驗

鄭小蘭 程龍飛 黃 瑜

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013）

傳染性漿膜炎是由鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種接觸性傳染性疾病，常常引起10周齡以內(nèi)的鴨和鵝等水禽發(fā)病，臨診呈急性或慢性敗血癥過程，發(fā)病率多為10%～40%，最高可達(dá)70%，病死率為5%～80%，主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎等[1]。鴨疫里默氏菌是造成水禽發(fā)病和死亡的重要細(xì)菌性病原，該病在我國所有水禽養(yǎng)殖區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重影響了我國水禽業(yè)的健康發(fā)展。鴨疫里默氏菌對藥物的耐受力強，常出現(xiàn)雙重或者多重耐藥性[2-3]，使得藥物的治療效果大打折扣。因此，臨床中應(yīng)根據(jù)分離菌的藥敏試驗結(jié)果選擇合適的藥物進(jìn)行治療。我們從福州市及周邊水禽養(yǎng)殖場分離到4株鴨疫里默氏菌，并進(jìn)行血清型鑒定及藥物敏感試驗，為臨床用藥的選擇提供了參考依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源 4個病例分別來自福清 （26日齡鵝）、連江（12日齡番鴨）、閩清（33日齡半番鴨）和閩候（22日齡鵝），發(fā)病率10%左右，病死率20%左右，剖檢病變相似，均可見心包膜增厚并與胸骨粘連、肝臟腫大并覆蓋有易撕脫的灰白色纖維素性假膜、氣囊增厚并有數(shù)量不等的灰白色假膜沉積。

1.2 試劑及配制 EasyPure Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix，北京全氏金生物科技有限公 司 產(chǎn) 品 ；tryptone、yeast Extract，OXOID 有 限 公 司產(chǎn)品；胎牛血清，Capricorn科學(xué)有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，北京天壇藥物生物科技有限公司產(chǎn)品；Tryptic soy Agar，美國BD公司產(chǎn)品。

LB 培養(yǎng)基：取 tryptone 10 g，yeast Extract 5 g和NaCl 10 g溶解于1 000 mL單蒸水中，調(diào)節(jié)pH值為7.4，分裝，121℃高壓滅菌 30 min。

TSA平板：取Tryptic soy Agar 4 g溶于100 mL單蒸水中，121℃高壓滅菌30 min，自然冷卻至60℃左右時，加入2%（V/V）胎牛血清，混勻后分裝于平板。

1.3 細(xì)菌的分離 無菌條件下取腦組織，劃線接種于TSA平板，37℃燭缸內(nèi)培養(yǎng)24 h。挑取單個圓形、凸起、邊緣整齊、半透明的菌落，劃線于TSA平板，37℃燭缸內(nèi)培養(yǎng)24 h，獲得純化菌。從純化菌中挑取3~4個菌落接種于LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。取少量純化菌液按常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

1.4 細(xì)菌的種鑒定

1.4.1 核酸提取及定量 取純化的菌液1 mL，8 000 r/min離心5 min，棄上清，按DNA/RNA Kit的操作規(guī)程提取核酸。取1 μL核酸以 NANODROP 2000測定其核酸濃度，調(diào)整到100 ng/μL作為模板。4株細(xì)菌分別進(jìn)行。

1.4.2 PCR反應(yīng)體系及程序 根據(jù)文獻(xiàn)[4]合成下列引物，預(yù)期擴增片段為280 bp。

上游引物：RTF：5'-GGAGACGTAGGAGTAAGAGG-3'。

下 游 引 物 ：RTR：5'-CATGAAACCCCTACACCGTG-3'。

配制 50 μL的 PCR反應(yīng)體系， 其中 2×Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，模板 1 μL，ddH20 22 μL。PCR 程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性45 s，52℃退火 30 s，72℃延伸30 s， 循環(huán) 30次；72℃ 延伸 10 min。 取 PCR產(chǎn)物 4 μL以 1%瓊脂糖凝膠（含GoldView）電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.5 血清型鑒定 取純化菌液20 μL滴于干燥潔凈的載玻片，滴加鴨疫里默氏菌陽性血清10 μL，混勻并攪拌，靜置2~3 min后觀察，液體清亮并出現(xiàn)絮狀沉淀，即判定為陽性。

1.6 藥敏試驗 紙片法進(jìn)行藥敏試驗，取純化菌的培養(yǎng)液均勻涂布于TSA平板，待菌液吸收后，將藥敏紙片（本次試驗共應(yīng)用了23種藥敏紙片）按一定間距擺放在平板上，37℃燭缸內(nèi)培養(yǎng)24 h。量取每個藥敏紙片抑菌圈的直徑，按中國藥檢所制定的標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌對藥物的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的分離 4個病例的病料接種培養(yǎng)后，在TSA平板上均可見大小、形態(tài)一致的菌落，菌落呈圓形、凸起于培養(yǎng)基、邊緣整齊、半透明，45°角度肉眼觀察有淡藍(lán)色光澤。4個病例分離的菌株分別命名為FQ、LJ、MQ、MH。 4株菌經(jīng)革蘭氏染色、顯微鏡下觀察，均為革蘭氏陰性，無芽孢，呈小桿菌狀。

2.2 細(xì)菌的PCR鑒定 以4株細(xì)菌的核酸為模板，經(jīng)PCR擴增，均擴增出單一的PCR條帶，片段大小約為280 bp（見圖1），與預(yù)期的相符。

圖1 4株細(xì)菌的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.3 細(xì)菌的血清型鑒定 4株菌的菌液均與1型鴨疫里默氏菌陽性血清發(fā)生凝集，均不與2、6、7、10、11、13、14、17型陽性血清發(fā)生凝集，判定為1型鴨疫里默氏菌。

2.4 藥敏試驗 4株細(xì)菌的藥物敏感試驗結(jié)果見表1。所有菌株都表現(xiàn)出多重耐藥性，耐受的藥物都不低于6種，其中LJ株耐受的藥物高達(dá)13種，說明鴨疫里默氏菌臨床分離株的藥物耐受性很強。4株細(xì)菌均耐受的藥物有多粘菌素B、卡那霉素、林可霉素和青霉素。4株細(xì)菌均敏感的藥物有氟苯尼考、強力霉素和壯觀霉素，75%菌株敏感的藥物有丁胺卡那霉素、頭孢唑啉、左氧氟沙星和四環(huán)素等。

表1 各菌株的藥物敏感試驗結(jié)果

3 討 論

鴨疫里默氏菌目前呈全球分布，血清型也在不斷發(fā)展更新，2002年國際上公認(rèn)有21種血清型，之后國內(nèi)又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了新的血清型[5]。不同時期不同地區(qū)流行的血清型也不盡相同。本試驗近期從福州及周邊水禽養(yǎng)殖場分離的鴨疫里默氏菌均為1型，說明1型鴨疫里默氏菌仍是近期福州及周邊流行的主要血清型，與前幾年流行的以1、2和11型為主的情況略有差異[4]，應(yīng)當(dāng)引起重視。

鴨疫里默氏菌對藥物的耐受性較強，不同時期不同地區(qū)分離的菌株，其藥物敏感性不同。如黃美玲等從廣東分離的菌株對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟高度敏感[6]，程冰花等從安徽分離的菌株對頭孢類、喹諾酮類和氯霉素類藥物的敏感性較高[7]。本次試驗表明，4株1型鴨疫里默氏菌中，全部菌株敏感的藥物有氟苯尼考、強力霉素和壯觀霉素，75%菌株敏感的藥物有丁胺卡那霉素、頭孢唑啉、左氧氟沙星和四環(huán)素等。該結(jié)果提示，近期福州及周邊區(qū)域傳染性漿膜炎的預(yù)防和治療藥物，優(yōu)先選擇氟苯尼考、強力霉素和壯觀霉素，丁胺卡那霉素、頭孢唑啉、左氧氟沙星和四環(huán)素等也可供選擇。