BICC1 對骨髓基質(zhì)細(xì)胞定向分化的調(diào)控作用研究

楊俊英，李曉霞

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，天津300070）

骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells,BMSC）是成體骨髓中一種多能干細(xì)胞，能夠分化為包括脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞[1-2]。研究表明，BMSC 向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化過程存在著一定的相互制約的動(dòng)態(tài)關(guān)系，二者此消彼長，若該過程失衡將可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生[3-5]。因此，對BMSC 的研究可能為預(yù)防和治療這類疾病的發(fā)生提供新的治療方向。

雙尾-C 基因（Bicc family RNA binding protein 1,Bicc1）編碼產(chǎn)物是一種由977 個(gè)氨基酸組成的保守的RNA 結(jié)合蛋白[6]，在體外可以與RNA 結(jié)合，使mRNA 3′-UTR 在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生多腺苷酸化，從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7-8]。目前發(fā)現(xiàn)，與Bicc1基因突變相關(guān)的小鼠模型均出現(xiàn)腎臟囊性變，其表型與人類多囊腎疾病病理表型高度相似[9]。有研究篩選了與BICC1 蛋白相互作用的因子，發(fā)現(xiàn)BICC1能夠與糖異生酶、乙酰輔酶A 羧化酶α 及脂肪酸合成酶等多種酶結(jié)合[10-11]，表明其可能在多種代謝途徑中發(fā)揮作用。目前，BICC1 在骨代謝相關(guān)疾病中的作用和調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究以BMSC 系ST2 為研究對象，探討B(tài)ICC1 對BMSC 定向分化的調(diào)控作用，為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 ST2 細(xì)胞由本室保存；限制性內(nèi)切酶、α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、Opti-MEM、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Thermo Fisher 產(chǎn)品；ClonExpress?Ⅱ克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物及BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試劑盒購自生工生物；Attractene 轉(zhuǎn)染試劑為QIAGEN 產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒購買自GeneMark 公司；抗壞血酸、β-甘油磷酸、胰島素、地塞米松、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、油紅 O 為 Sigma 產(chǎn)品；β-actin、C/EBPα、aP2 及 PPARγ 抗體為 Proteintech 產(chǎn)品，RunX2 抗體購自 CST 公司，ALP、Osteopontin 抗體為Abcam 產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 建立Bicc1 過表達(dá)質(zhì)粒 小鼠ST2 cDNA 為模板擴(kuò)增Bicc1 編碼序列，在上下游分別引入Kpn I和Xab I 酶切位點(diǎn)。引物序列為：Fw: 5′-TAGCGTT TAAACTTAAGCTTGGTACCGCCACCATGGCCTCGC AGAGCGAG -3′ ；Rev:5′ -GTTTAAACGGGCCCTC TAGACTACCAGCG GCCACTGACGCT-3′。按照 95℃預(yù)變性 2 min，35 個(gè)循環(huán)（95℃ 30 s；56℃ 30 s；72℃1 min），72℃ 10 min 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。將擴(kuò)增片段進(jìn)行純化回收，利用ClonExpress?Ⅱ克隆試劑盒克隆，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取質(zhì)粒后用KpnI/XabI進(jìn)行酶切鑒定和測序，將測序正確的重組子命名為Bicc1-pcDNA3.1。

1.2.2 ST2 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含5% FBS、1%雙抗的α-MEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞ST2于24 孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對照組pcDNA3.1 與實(shí)驗(yàn)組Bicc1-pcDNA3.1 質(zhì)粒（375 ng/孔）及轉(zhuǎn)染試劑 Attractene（0.75 μL/孔）分別稀釋于 Opti-MEM（25 μL/孔），混勻后室溫靜置5 min，然后向含有質(zhì)粒的混合物中加入等量的轉(zhuǎn)染試劑混合物，混勻后室溫靜置18 min，緩慢滴加于24 孔板（50 μL/孔）后培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染 12～18 h 后換 α-MEM 完全培養(yǎng)基。

1.2.3 成骨分化誘導(dǎo) 待細(xì)胞匯合度達(dá)80% 時(shí)，更換含有 50 μg/mL 抗壞血酸、5 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM 完全培養(yǎng)基，每3 d 換液，至第14天進(jìn)行堿性磷酸酶染色。

1.2.4 成脂分化誘導(dǎo) 待細(xì)胞匯合度達(dá)100% 時(shí)，更換含有 0.5 μmol/L 地塞米松、0.25 mmol/L IBMX、5 μg/mL 胰島素、50 μmol/L 吲哚美辛的 α-MEM 完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)3 d 后更換含有5 μg/mL 胰島素的α-MEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 d 進(jìn)行油紅O 染色。

1.2.5 堿性磷酸酶染色 棄去孔板中的培養(yǎng)基，1×PBS 洗滌細(xì)胞2 次后用4% 多聚甲醛室溫固定15 min，棄固定液，1×PBS 洗滌 1 次，NBT/BCIP 堿性磷酸酶染色劑盒避光染色15 min，用Image J 軟件對染色進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 油紅O 染色 棄去孔板中的培養(yǎng)基，1×PBS洗滌細(xì)胞 2 次，4% 多聚甲醛固定 15 min，1×PBS 洗滌 1 次，加 60% 異丙醇（200 μL/孔），1 min 后棄去，加入油紅O 染液室溫染色5 min。鏡下觀察脂滴著色情況。蒸餾水輕輕沖洗，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞分化情況并拍照；待培養(yǎng)板晾干后，加入100 % 異丙醇（100 μL/孔），室溫靜置 20 min，萃取油紅 O，用分光光度計(jì)測定OD520。

1.2.7 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞誘導(dǎo)2 d 后采用GeneMark 總RNA 提取試劑盒提取RNA 并逆轉(zhuǎn)成cDNA，然后進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：模板cDNA 2 μL，特異性上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，去離子水 2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3 min，35 個(gè)循環(huán)（95℃ 5 s；56℃ 15 s；72℃ 15 s）。以 β-actin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的各目的基因相比于對照組的mRNA 相對表達(dá)量，其中ΔCt=Ct目的mRNACt內(nèi)參mRNA；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，引物見表 1。

1.2.8 Western blot 細(xì)胞誘導(dǎo) 3 d 后提取蛋白，10%SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，牛奶室溫封閉2 h，4℃孵一抗過夜，1×TBST 洗 3 次，每次 10 min，室溫孵二抗 2 h，1×TBST 洗 3 次，每次 10 min，曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示。組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建Bicc1 過表達(dá)質(zhì)粒 以小鼠ST2 cDNA 為模板擴(kuò)增Bicc1 編碼區(qū)序列，克隆于pcDNA3.1，命名為Bicc1-pcDNA3.1。酶切鑒定（圖1）及測序結(jié)果顯示過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 Bicc1-pcDNA3.1 在 ST2 細(xì)胞過表達(dá) 轉(zhuǎn)染Bicc1-pcDNA3.1 后，ST2 細(xì)胞中 Bicc1 mRNA 表達(dá)水平較對照組升高15.23 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P＜0.05），見圖2。

表1 qRT-PCR 引物Tab 1 qRT-PCR primer

圖1 Bicc1 過表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig 1 Identification of Bicc1 construct by enzyme digestion

2.3 BICC1 促進(jìn)ST2 細(xì)胞成骨分化 轉(zhuǎn)染Bicc1過表達(dá)質(zhì)粒后，ST2 細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色較對照組增強(qiáng)（圖3A）。對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組（0.504±0.006）的平均光密度值較對照組（0.368±0.003）明顯升高（圖3B）；成骨特異性基因osterix（Osx）、ALP、骨橋蛋白（OPN）和骨鈣素（Oc）的mRNA 表達(dá)上調(diào)，分別為對照組的 2.93、4.19、2.55 和3.02 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （n=3，P＜0.05）（圖3C）。ALP、OPN 和Runx2的蛋白表達(dá)上調(diào)（圖3D）。

圖2 Bicc1 過表達(dá)效率Fig 2 The overexpression of Bicc1 after transfection

2.4 BICC1 抑制ST2 細(xì)胞成脂分化 轉(zhuǎn)染Bicc1過表達(dá)質(zhì)粒后，ST2 細(xì)胞成脂分化減少，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組油紅O 染色陽性脂滴減少（圖4A）。對油紅O 染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組（0.288±0.022）的 OD520測定值明顯低于對照組（0.418±0.048）（圖4B）；成脂特異性基因 PPARγ、C/EBPα、aP2 和 adipsin 的mRNA 表達(dá)分別下降 43%、38%、37% 和 49%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，均 P＜0.05）（圖4C），PPARγ、C/EBPα 和 aP2 的蛋白表達(dá)下調(diào)（圖4D）。

圖3 BICC1 促進(jìn)ST2 成骨分化Fig 3 Overexpression of BICC1 in ST2 promoted osteoblast differentiation

圖4 BICC1 抑制ST2 細(xì)胞成脂分化Fig 4 Overexpression of BICC1 in ST2 inhibited adipocyte differentiation

3 討論

多囊腎病（PKD）是一種退行性的常染色體隱性遺傳疾病，與Pkd1 和Pkd2 基因（分別編碼多囊蛋白-1 和多囊蛋白-2）突變有著密切的關(guān)系[12]。近期研究發(fā)現(xiàn)，多囊蛋白復(fù)合物對成骨細(xì)胞也有著重要的調(diào)控作用，Pkd1 在成骨細(xì)胞中缺失，可通過多囊蛋白-1和TAZ 的相互作用從而降低Runx2 表達(dá)而增加PPARγ 表達(dá)，使得骨形成減少[13-14]。Pkd1-/-模型小鼠腎臟細(xì)胞中Bicc1 的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示Bicc1的表達(dá)與Pkd1 密切相關(guān)[15]。

Bicc1 是果蠅雙尾C 基因的同源基因，其編碼產(chǎn)物普遍存在于從線蟲到人類的各個(gè)物種中，并且序列高度保守[16]，參與胚胎內(nèi)腎臟的形成[17]。Bicc1等位基因突變小鼠（Bicc1jcpk）由于終止密碼子提前出現(xiàn)產(chǎn)生功能缺陷的BICC1，表現(xiàn)出嚴(yán)重的早發(fā)性PKD，與人類常染色體顯性多囊腎病極為相似。通過全基因組關(guān)聯(lián)性研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)，Bicc1 與骨密度相關(guān)基因Bmd42、Bmd43 有著密切的聯(lián)系。測量Bicc1jcpk小鼠的骨密度，結(jié)果顯示在28 周時(shí)雜合Bicc1+/jcpk雄性小鼠股骨的骨密度（BMD）明顯低于野生型小鼠，由此可以推測，Bicc1 基因表達(dá)減少可能導(dǎo)致了骨密度的降低。通過分離模型小鼠顱骨細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，結(jié)果顯示ALP 活性顯著降低，成骨標(biāo)志物的表達(dá)降低，證實(shí)BICC1 能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性[18]。目前關(guān)于BICC1 在成骨分化和脂肪分化中作用的研究相對較少，尤其是脂肪分化方面鮮有報(bào)道。因此，本研究通過構(gòu)建Bicc1 過表達(dá)質(zhì)粒，以BMSC ST2 為細(xì)胞模型，來探討 BICC1 對BMSC 的調(diào)控功能。

本實(shí)驗(yàn)中，通過轉(zhuǎn)染的方式使Bicc1 在ST2 細(xì)胞中高表達(dá)，隨后分析了Bicc1 對骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的作用。結(jié)果顯示，Bicc1 高表達(dá)后，ST2 成骨分化顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為成骨誘導(dǎo)后Bicc1 高表達(dá)組ALP 染色增強(qiáng)，Runx2、Osterix、Oc、OPN 及骨涎蛋白（BSP）等成骨特異性基因的mRNA 和/或蛋白表達(dá)水平均顯著升高。由此推測，BICC1 可以促進(jìn)BMSC 向成骨細(xì)胞分化。

骨穩(wěn)態(tài)依賴于破骨細(xì)胞再吸收和成骨細(xì)胞骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡[19]，成骨細(xì)胞的活力與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分化密切相關(guān)[20]。成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞都來源于BMSC，在分化過程中存在著彼此競爭的關(guān)系，對骨穩(wěn)態(tài)的維持有著重要的作用[21-23]。因此筆者進(jìn)一步檢測了BICC1 對BMSC 成脂分化的調(diào)節(jié)作用。成脂誘導(dǎo)后，Bicc1 高表達(dá)組脂肪細(xì)胞分化明顯減少，胞內(nèi)儲(chǔ)脂降低。此外，PPARγ、C/EBPα、aP2 及adipsin 等脂肪特異性基因mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著下降。由此推測，BICC1 可以抑制BMSC 向脂肪細(xì)胞分化。

綜上，本研究結(jié)果提示BICC1 可以調(diào)節(jié)BMSC成骨及成脂分化的平衡，這可能是其影響骨穩(wěn)態(tài)和骨密度的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。BICC1 可能參與了骨質(zhì)疏松骨再建紊亂的病理機(jī)制，調(diào)節(jié)BICC1 表達(dá)水平可能成為改善骨健康狀態(tài)的有效策略。