miR-20a-5p 調控成骨細胞分化相關靶基因的篩選及靶向關系驗證

李亞沖，劉穎，朱恩東

（1.天津醫科大學口腔醫院牙體牙髓科，天津300070；2.天津醫科大學朱憲彝紀念醫院生化與分子生物學研究室，國家衛生健康委員會激素與發育重點實驗室,天津市代謝性疾病重點實驗室，天津市內分泌研究所，天津300134）

microRNA 是一類長度為18～25 個核苷酸的小的非編碼內源性RNA 分子，可以通過與靶基因mRNA 3′非翻譯區（3′UTR）發生完全或不完全互補配對，致使mRNA 降解或翻譯被抑制，從而在轉錄水平或轉錄后水平調控基因的表達[1]。近期研究發現，miR-20a-5p 在組織和器官發育中發揮重要作用[2]。例如，miR-20a-5p 可延長細胞外信號調節激酶（ERK）磷酸化，同時上調血管生成基因（如成纖維細胞生長因子9）的表達[3]，并且miR-20a-5p可以通過抑制組蛋白去甲基化酶Kdm6b 及轉錄因子Kruppel 樣因子3（Klf3）等靶基因的表達，促進間充質干細胞的成脂分化[4-5]。Zhang 等[6]研究發現，miR-20a-5p 可通過靶向抑制過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）的表達促進人間充質干細胞的成骨分化。此外，本課題組的前期研究初步證實了miR-20a-5p 具有促進小鼠間充質干細胞向成骨細胞分化的功能[4]。然而，筆者檢測發現小鼠PPARγ mRNA 3′UTR 區并不存在 miR-20a-5p 的結合位點，而且miR-20a-5p 不能抑制小鼠PPARγ 基因蛋白水平的表達，因此miR-20a-5p 在成骨分化過程中的靶向分子機制尚需進一步研究。深入了解microRNA 調控成骨分化的分子機制將有助于完善對骨代謝相關疾病的認識。本研究旨在篩選miR-20a-5p在成骨分化中的靶向作用基因，進一步驗證其靶向關系，闡明miR-20a-5p 調控成骨分化的分子機制，為臨床利用microRNA 調控成骨細胞分化的生物學行為奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 高效率逆轉錄試劑盒購買自美國Ther mo Fisher 公司；SE 無縫克隆和組裝試劑盒購買自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Mut Express?II Fast Mutagenesis Kit 購買自南京諾唯贊生物科技有限公司；DMEM 高糖（DMEM/H）培養基購買自上海源培生物科技有限公司；Trizol 和LipofectamineTM2000 購買自美國 Invitrogen 公司；miR-20a-5p miR-NC 及miR-mimics 由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購買自美國Promega 公司；全自動酶標儀購買自美國伯騰儀器有限公司；流式細胞儀購買自美國BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HEK-293T 和MC3T3-E1 均用含有10% FBS 的DMEM/H 培養基，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 cDNA 的獲取 收集 MC3T3-E1 細胞，用Trizol 法提取總 RNA。取 0.5 μg 總 RNA 逆轉錄為cDNA。逆轉錄的條件：25℃ 10 min；42℃ 60 min；70℃ 10 min。

1.2.3 靶基因的預測 通過靶基因預測數據庫TargetScan 7.2（http://www.targetscan.org/mmu_72/）預測miR-20a-5p 的靶基因，選定Smad7 作為miR-20a-5p 的候選靶基因。

1.2.4 miR-20a-5p 靶基因熒光報告載體的構建 根據靶基因預測數據庫TargetScan 中查找的靶基因3′UTR 序列，設計Smad7 上下游特異性同源引物，上游引物：5′-TGA TGA AAG CTG CGC AAT CCC TTG GCT GGC TCC-3′，下游引物：5′-AAA AGA TCC TTT ATT AGC TAG GTG ATA ACA CCC ATA GAA-3′。

以上面逆轉錄合成的cDNA 為模板，用Smad7上下游特異性引物擴增Smad7 的3′UTR 序列。將pMIR-REPORT-Luciferase 載體進行 Spe I、HindⅢ雙酶切。利用SE 無縫克隆體系將Smad7 擴增產物和pMIR-REPORT-Luciferase 載體酶切產物于37℃進行重組反應30 min，取重組產物轉化DH5α 感受態細胞，均勻涂布在含有氨芐抗性的固體LB 平板上，倒置于37℃孵箱過夜培養。于平板中挑取單菌落送交測序，測序正確的樣品進一步提取重組質粒，命名為pMIR-LUC-Smad7，置于-80℃儲存備用。

設計Smad7 點突變上下游引物，上游引物：5′-AAG ATC CTC ATA GCT TTA ATA TAA ATG CAA ATA ACA TGC CAA AT-3′，下游引物：5′-AAA GCT ATG AGG ATC TTT TCT TTA TTC TTC TCG TTT ATA CAC ATT G-3′。以 pMIR-LUC-Smad7 為模板，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 進行載體擴增，擴增產物使用DpnI 于37℃消化1 h 去除甲基化模板質粒；然后用Exnase Ⅱ使擴增產物同源重組。挑選測序結果正確樣品提取質粒，命名為 pMIR-LUC-Smad7-MUT，置于-80℃保存備用。

1.2.5 miR-20a-5p 靶基因綠色熒光（GFP）報告載體的構建 設計擴增eGFP 的上下游特異性引物，上游引物：5′-CGG GAT CCA CCA TGG TGA GCA AGG GCG AGG -3′，下游引物：5′-CCG CTC GAG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3′。以質粒pMIR-REPORT-eGFP 為模板進行PCR 擴增，將擴增產物 pMIR-LUC-Smad7 和 pMIR-LUC-Smad7-MUT 分別使用Bam H I 和 Xho I 進行雙酶切。利用T4 DNA 連接酶分別將eGFP 與pMIR-LUC-Smad7或pMIR-LUC-Smad7-MUT 酶切產物進行連接。測序正確的樣品提取質粒并命名為pMIR-GFPSmad7 及pMIR-GFP-Smad7-MUT，存放于-80℃保存備用。

1.2.6 雙熒光素酶檢測 將處于對數生長期的HEK-293T 細胞接種于 96 孔板，24 h 后貼壁細胞達70%匯合率時進行轉染。將合成的miR-20a-5p miR-mimics 或陰性對照 miR-NC 與已構建的pMIR-LUC-Smad7 或 pMIR-LUC-Smad7-MUT、質粒pRL-TK 共轉染HEK-293T 細胞。轉染24 h 后，用 Dual-Luciferase?Reporter Assay System 試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.7 GFP 抑制實驗 將處于對數生長期的HEK-293T 細胞接種于24 孔板，24 h 后貼壁細胞達70%匯合率時進行轉染。將miR-20a-5p miR-mimics 或miR-NC 與已構建的 pMIR-GFP-Smad7 或pMIRGFP-Smad7-MUT 共轉染HEK-293T 細胞。轉染24 h 后，先用OLYMPUS 倒置熒光顯微鏡觀察拍照，然后經BD FACSVerseTM流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析處理。實驗數據以表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組樣本中兩組間比較首先進行獨立樣本單因子變異數分析（one-way ANOVA），然后做 Tukey 或 Dunnett’s T3 檢測。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-20a-5p 靶基因預測 根據靶基因預測數據庫 TargetScan 7.2（http://www.targetscan.org/mmu_72/）對miR-20a-5p 的靶基因進行預測，將在轉化生長因子（TGF）-β 信號通路中發揮抑制作用的 Smad 家族成員Smad7 選為miR-20a-5p 的候選靶基因。包括小鼠、大鼠及人等在內的11 個脊椎動物的Smad7 基因 3′UTR 都有保守的 miR-20a-5p 結 合種子序列 GCACTTT（圖1）。

圖1 miR-20a-5p 識別結合Smad7mRNA3′UTR 的生物信息學分析Fig 1 Bioinformatics analysis of miR-20a-5p binding to 3′UTR of Smad7 mRNA

2.2 熒光素酶報告基因載體的構建 以小鼠MC3T3-E1 細胞的cDNA 為模板，利用PCR 技術擴增長度為447 bp 的序列（圖2A），經同源重組將擴增片段連接至熒光素酶報告載體pMIR-REPORTLuciferase，命名為 pMIR-LUC-Smad7。 pMIRLUC-Smad7 重組質粒及PCR 特異性擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳可見插入片段長度正確，經測序確定插入片段堿基序列亦正確（圖2B 泳道1、2）。用點突變特異性引物擴增pMIR-LUC-Smad7 后進行同源重組構建得到miR-20a-5p 結合種子序列GCACTTT 突變為 CCTCATA 的重組質粒 pMIRLUC-Smad7-MUT（圖3）。pMIR-LUC-Smad7-MUT重組質粒及PCR 特異性擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳可見插入片段長度正確，經測序確定插入片段堿基序列亦正確（圖2B 泳道 3、4）。

圖2 Smad7 mRNA 3′UTR 擴 增 、pMIR-LUC-Smad7、pMIRLUC-Smad7-MUT 構建及其 PCR 鑒定Fig 2 Amplification of Smad7 mRNA 3′UTR，construction and PCR identification of pMIR -LUC -Smad7 and pMIR -LUC -Smad7-MUT

圖3 miR-20a-5p 識別結合Smad7 mRNA 3′UTR 種子序列及其突變序列Fig 3 The wildtype and mutant seed sequence of miR-20a-5p recognizing Smad7 mRNA 3′UTR

2.3 GFP 報告基因載體的構建 以質粒pMIRREPORT-eGFP 為模板，利用PCR 技術擴增長度為720 bp 的 eGFP 表達序列（圖4 泳道2）。將 pMIRLUC-Smad7 及 pMIR-LUC-Smad7-MUT 分別經雙酶切去除熒光素酶報告基因，然后將eGFP 表達序列分別插入上述兩個載體，測序及PCR 擴增結果均顯示插入eGFP 表達序列正確（圖4 泳道3～6）。

圖4 eGFP 擴增、pMIR-GFP-Smad7，pMIR-GFP-Smad7-MUT構建及其PCR 鑒定Fig 4 Amplification of eGFP，construction and PCR identification of pMIR-GFP-Smad7 and pMIR-GFP-Smad7-MUT

2.4 雙熒光素酶活性檢測 雙熒光素酶活性檢測結果顯示，pMIR-LUC-Smad7 與 miR-mimics 共轉染組與其對照組相比熒光素酶活性降低；而pMIRLUC-Smad7-MUT 與miR-mimics 共轉染組與對照組相比，熒光素酶活性未見明顯變化（圖5）。

圖5 雙熒光素酶報告系統驗證miR-20a-5p 與靶基因Smad7 mRNA 3′UTR 的相互作用Fig 5 Dual luciferase reporter system validated the interaction of miR-20a-5p with Smad7 mRNA 3′UTR

2.5 GFP 抑制實驗 相關重組載體與miR-20a-5p miR-NC 及miR-mimics 共轉染的細胞經倒置熒光顯微鏡觀察可見，與對照組相比，pMIR-GFP-Smad7與miR-mimics 共轉染組GFP 表達陽性細胞比例顯著降低，而pMIR-GFP-Smad7-MUT 與miR-mimics共轉染組與對照組相比GFP 表達陽性細胞比例未見顯著差異（圖6A）。流式細胞儀測定結果與倒置熒光顯微鏡觀察結果一致，pMIR-GFP-Smad7 與miR-mimics 共轉染組較其他組GFP 表達陽性細胞比例顯著減少（圖6B，6C）。

圖6 GFP 抑制實驗驗證miR-20a-5p 與靶基因Smad7 mRNA 3′UTR 的相互作用Fig 6 GFP repression assay confirmed the interaction of miR-20a-5p with Smad7 mRNA 3′UTR

3 討論

骨質疏松癥是一種骨質流失的全身系統性疾病，流行病學調查結果顯示，我國50 歲以上的人群中骨質疏松癥患病率為：女性20.7%，男性14.4%。骨質疏松是多因素過程，其主要特征是骨量減少和骨密度降低。促進骨質形成、增加骨量是治療骨質疏松的有效手段[7-8]。而骨形成與間充質干細胞的增殖以及向成熟的成骨細胞分化有關，因此，成骨分化是骨形成的一個關鍵因素[9-10]。

近年來的研究表明，大量miRNAs 參與成骨細胞的分化過程，在調節骨再生的過程中發揮著重要作用[11-12]。例如 microRNA-130a 通過靶向 Smurf2 基因的3′UTR 區促進骨髓間充質干細胞的成骨分化[13]。miR-20a-5p 在人間充質干細胞中通過抑制人PPARγ 基因表達及調控BMP 信號通路，從而促進成骨分化[6]。然而，Zhou 等[4]的研究結果表明，通過microRNA 靶基因預測數據庫并未預測到PPARγ為miR-20a-5p 的潛在靶基因；另外，miR-20a-5P不能改變小鼠PPARγ 3′UTR 構建體的熒光素酶活性；而且，miR-20a-5p 不能抑制小鼠PPARγ 基因蛋白水平的表達。因此，miR-20a-5p 在成骨分化過程中的靶向分子機制尚需進一步研究。

本研究首先通過生物信息學預測發現在TGF-β信號通路中發揮抑制作用的Smad 家族成員Smad7可能是miR-20a-5p 的潛在靶基因。Smad 家族轉錄因子是TGF-β 細胞因子信號轉導通路的關鍵因子，該信號轉導通路在動物胚胎發育和組織再生等多個生命進程中發揮重要作用。Smad7 能夠通過和活化受體相互作用使TGF-β 信號通路失去活性而發揮抑制成骨分化的作用[14]。

為探究miR-20a-5p 對Smad7 的靶向作用，本研究首先成功將Smad7 3′UTR 克隆至雙熒光素酶報告基因載體以及綠色熒光報告基因載體上，然后將構建成功的報告基因與miR-20a-5p mimics 或NC mimics 共轉染HEK-293T 細胞，雙熒光素酶活性檢測和綠色熒光抑制實驗結果顯示，與對照組相比，miR-20a-5p 顯著抑制報告基因載體表達的綠色熒光蛋白及熒光素酶活性，提示miR-20a-5p 可能通過直接作用于靶基因Smad7，在成骨分化中發揮調控作用。

綜上，本研究結果表明：miR-20a-5p 能夠直接靶向作用于 Smad7 的 3′UTR。而 Smad7 與 TGF-β信號通路有著十分密切的聯系。因此，筆者將進一步研究確定miR-20a-5p 是否通過阻斷靶基因Smad7 在TGF-β 信號通路中的抑制作用而促進成骨分化。對成骨調控機制的研究，將為骨質疏松等骨代謝相關疾病的治療提供新的藥物靶點。