體外膜氧合再灌注豬心臟死亡供體后腸黏膜屏障功能的改變

馬寧，劉蕾，劉懿禾，史源，陳靜，張驪，郭慶軍，蔣文濤，沈中陽

（1.天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津300192；2.天津市第一中心醫(yī)院，天津300192）

近年來，體外膜氧合技術（ECMO）應用于心臟死亡器官捐獻（DCD）供體的研究顯著增加，特別是對DCD 供體肝、腎等器官的循環(huán)支持、體外修復及相關機制研究是目前ECMO 在該領域的研究熱點[1-2]。包括腸道在內，DCD 供體器官存在不同程度的低灌注打擊和熱缺血損傷，腸黏膜屏障損傷可引起腸內菌群異位、毒素入血，從而影響其他組織器官功能[3-4]。ECMO 在對DCD 供體的保護、支持過程中是否會對腸黏膜屏障功能也提供相關保護還是造成進一步損傷尚不完全清楚，因此明確這一過程中腸黏膜屏障功能變化十分必要。本實驗應用巴馬小型豬，模擬臨床建立馬斯特里赫特（Maastricht）Ⅱ類DCD 模型，應用ECMO 再灌注DCD 供體后觀察腸黏膜屏障功能的變化情況，為ECMO 相關損傷修復機制研究提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 20 只雌雄不限健康成年巴馬小型豬作為實驗對象，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，體質量30～35 kg，月齡10～12 個月，實驗前給予禁食24 h，禁水12 h處理。

1.2 麻醉與豬心臟死亡模型的建立 經(jīng)臀大肌注射氯胺酮10 mg/kg、安定0.4 mg/kg 及阿托品0.03 mg/kg 行基礎麻醉，麻醉后稱體質量，將豬仰臥位固定于恒溫手術臺，胸前連接五導聯(lián)心電監(jiān)護，通過耳緣靜脈建立外周靜脈通路，給予氯化琥珀膽堿1 mg/kg 誘導麻醉，然后行氣管插管，連接麻醉機，設置吸入氧氣濃度為40%，流量為1 L/min，潮氣量為10 mL/kg，呼吸頻率為18 次/min，吸呼比為1:2，術中七氟烷吸入作麻醉維持。麻醉完成后，經(jīng)頸部右側縱行切口，游離頸內動脈和頸內靜脈并置管，頸內動脈置管用于術中監(jiān)測平均動脈壓及采集血樣，頸內靜脈置入中心靜脈導管，用于術中監(jiān)測中心靜脈壓和液體輸注。于上腹部正中行縱行切口，充分游離腎動、靜脈水平以下腹主動脈和下腔靜脈，以備ECMO 置管。參考文獻[5]方法建立豬MaastrichtⅡ類心臟死亡模型。靜脈推注氯化鉀1 g 和肝素3 mg/kg，當心電監(jiān)護提示出現(xiàn)室顫后使用心肺復蘇機給予標準心臟按壓[6]，按壓頻率為100 次/min，按壓深度為5 cm，期間呼吸機維持呼吸。心肺復蘇（CPR）30 min 后關閉所有心肺支持，心電監(jiān)護示直線，在5 min 不接觸（no touch）時間內若無心電活動及自主呼吸，判定豬心臟死亡。即成功建立豬心臟死亡模型。

1.3 ECMO 建立與運行 判定豬心臟死亡后，迅速經(jīng)腹主動脈下行分叉水平以上部位置入15Fr ECMO 插管，插管深度為插管尖端應位于腎動脈開口處；再經(jīng)同一水平于下腔靜脈中置入19Fr ECMO 插管，插管尖端位于肝靜脈開口處，然后將插管與ECMO 管路連接。其中動脈插管與管路連接中間放置三通管，用于ECMO 運行過程中血壓監(jiān)測及血樣采集。剪開膈肌，將胸主動脈貼近膈肌處夾閉，防止血液分流。開始運行ECMO，ECMO 參數(shù)設定為：溫度 38～39℃，流量 30 mL/kg，氧流量 3 L/min。ECMO運行過程中持續(xù)給予肝素泵入抗凝，維持活化凝血時間(ACT)＞300 s。

1.4 樣品收集及指標檢測 術中及ECMO 運行過程中持續(xù)監(jiān)測生命體征，每分鐘記錄平均動脈壓（MAP）。分別于基礎階段、判定心臟死亡時、ECMO運行2 h、4 h 及6 h 時獲取血液標本，酶聯(lián)免疫分析法測定血清中內毒素、二胺氧化酶（DAO）和腸型脂肪酸結合蛋白（I-FABP）水平；在相同時間點，各獲取面積為0.5 cm×0.5 cm 的全層小腸組織用生理鹽水沖凈腸內容物后，通過甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE 染色進行小腸病理檢查。

1.5 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以表示，計量資料比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗基本情況 20 頭巴馬小型豬均成功建立心臟死亡模型，并順利運行ECMO 6 h。靜脈推注氯化鉀1 g 后16 頭巴馬小型豬即刻出現(xiàn)室顫，平均動脈壓降至 25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）以下，至心肺復蘇結束，復蘇過程中均無自主心率恢復。4 頭巴馬小型豬在心肺復蘇階段出現(xiàn)自主心率恢復，再次給予氯化鉀1 g 后，無自主心率恢復。此方法建立模型效果穩(wěn)定。ECMO 插管順利，運行15 min 后，小腸組織基本恢復粉紅色。實驗過程中，ECMO 流量30～35 mL/（kg·min），氧流量3 L/min，平均動脈壓基礎值為（82.25±5.07）mmHg，ECMO 運行過程中為（78.38±6.11）mmHg。持續(xù)肝素泵入，維持活化凝血時間（ACT）＞300 s。

2.2 血清學指標變化 與基礎階段比較，判定豬心臟死亡后，血清內毒素、DAO 及I-FABP 均明顯升高（均 P＜0.05）。ECMO 運行開始后，血清內毒素和DAO 在 2 h 及 4 h 時均呈明顯下降趨勢（均 P＜0.05），ECMO 運行6 h 時內毒素水平有輕度上升，DAO 較4 h 無明顯變化；血清I-FABP 呈先緩慢下降，后升高趨勢，在ECMO 運行前2 h 有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），ECMO 運行 4 h 時，下降顯著，到 6 h 時 I-FABP 水平明顯升高（P＜0.05，表 1）。

2.3 小腸組織病理學變化 當判定豬心臟死亡后，小腸組織外觀呈現(xiàn)淤紫暗紅色，腸壁無彈性、無水腫，小腸表層被覆上皮不完整、較多脫落，絨毛及黏膜腺體排列不規(guī)則，固有層中可見大量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞及漿細胞。隨著ECMO 的運行，小腸組織逐漸恢復粉紅色，顏色均勻，腸壁彈性逐漸恢復，腸蠕動明顯；病理表現(xiàn)亦有好轉趨勢，當ECMO運行至2 h 及4 h 時，光鏡下均見小腸表層被覆上皮偶見脫落，至ECMO 運行4 h 時，部分絨毛排列不規(guī)則，腸黏膜腺體排列大致規(guī)則，固有層有少量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞及漿細胞浸潤；當ECMO運行時間超過4 h 后，肉眼可見腸壁開始水腫，并呈逐漸加重趨勢，彈性較前變差，蠕動逐漸減弱，6 h病理切片可見小腸表層被覆上皮偶見脫落，部分絨毛脫落及萎陷，腸黏膜腺體排列大致規(guī)則，炎細胞浸潤較前加重（圖1）。

表1 實驗過程中血清內毒素、DAO 及I-FABP 水平的變化（）Tab 1 Changes of endotoxin, DAO and I-FABP levels during the experiment（）

表1 實驗過程中血清內毒素、DAO 及I-FABP 水平的變化（）Tab 1 Changes of endotoxin, DAO and I-FABP levels during the experiment（）

注：基礎階段為未推注氯化鉀誘導心臟死亡前；DAO 為二胺氧化酶，I-FABP 為腸型脂肪酸結合蛋白；與前一時間點血清學指標水平比較，aP＜0.05，bP＞0.05；與心臟死亡時比較，cP＜0.05，dP＞0.05

檢測時間點 n 內毒素（EU/mL）DAO（U/mL）I-FABP（ng/mL）基礎階段 20 0.231±0.032 51.83±8.70 17.91±3.12心臟死亡時 20 0.386±0.031a 76.63±9.36a 23.88±3.21a運行 ECMO 2 h 20 0.305±0.034a 66.28±5.98a 22.03±1.38b運行 ECMO 4 h 20 0.243±0.021ac 60.22±5.41ac 17.86±1.73ac運行 ECMO 6 h 20 0.251±0.023bc 59.36±8.40bc 22.48±1.96ad

圖1 建立豬心臟死亡模型及運行ECMO 過程中小腸組織病理改變（HE 染色×200）Fig 1 Pathological changes of the small intestinal in the process of establishing pig cardiac death model and ECMO circuit(HE×200)

3 討論

ECMO 已有近70 年的應用歷史，隨著器材的不斷改進以及近年來器官移植技術和研究的快速發(fā)展，ECMO 廣泛應用于供體移植物的保護、移植受者生命支持及移植后各種并發(fā)癥的搶救等[7]，特別是為緩解臨床供體短缺，ECMO 對DCD 器官供體的循環(huán)支持及質量修復成為研究熱點之一[8-9]。目前，國際上認為最具擴大供體器官來源的是Maastricht 心臟死亡分類標準中的Maastricht Ⅱ類[10]。因此本實驗設計建立在此類心臟死亡供體模型基礎上。相關研究表明，ECMO 技術可以用來選擇改善Maastricht Ⅱ類供體器官質量，西班牙巴塞羅那大學Fondevila 等[11]應用ECMO 在體修復4 h，使供體器官得到一定程度的恢復，后因供體腹腔滲出增多、ECMO 流量難以維持，腹腔器官質量變差而停止。截至目前，ECMO 對DCD 供體器官的保護機制尚不十分明確。包括腸道在內，DCD 供體器官存在不同程度的低灌注打擊和熱缺血損傷，腸黏膜結構和功能的損傷，可引起腸道細菌移位、內毒素入血，誘發(fā)全身炎性反應，從而造成多種組織器官的損害。相關研究認為，體外循環(huán)病人的腸道是導致膿毒血癥、全身炎性反應綜合征（SIRS）和多系統(tǒng)器官功能衰竭（MODS）的重要器官，是損傷的始動器官[12-13]。基于以上考慮，本實驗深入探討ECMO 再灌注DCD 供體過程中腸黏膜屏障功能是否能夠得到有效保護，還是進一步加重黏膜損傷，為這一過程中肝、腎、胰腺等其他器官的功能變化及相關機制研究提供新的思路。

筆者用靜脈推注氯化鉀，繼而給予標準心肺復蘇的方法成功建立了巴馬小型豬Maastricht Ⅱ類心臟死亡捐獻模型，模型成功率高、易于標準化。ECMO運行過程穩(wěn)定，轉速和流量分別為2 000～2 500 r/min和30～35 mL/（kg·min），運行ECMO 6 h 維持有效平均動脈壓（78.38±6.11）mmHg，保證了腸道血液灌注。在ECMO 運行15 min 后，腸道即恢復均勻粉紅色，接近正常顏色，利用肝素在建立心臟死亡模型及ECMO 運行過程中抗凝有效，血液灌注理想。評價腸黏膜屏障功能指標除病理學觀察，血清中DAO能準確、快速地反應腸道機械屏障的完整性和損傷程度，小腸黏膜中DAO 活性與黏膜上皮細胞的核酸和蛋白質合成相關，當腸黏膜屏障受損，DAO 進入腸細胞間隙淋巴管和血管中，血DAO 升高[14-15]。I-FABP 在黏膜中的含量最豐富，由于黏膜層對缺血最為敏感，腸缺血時I-FABP 能較早釋放，當腸道缺血15 min 后血清中即迅速增加，由于I-FABP 的特異性和敏感性，使其在判斷黏膜損傷程度方面具有顯著優(yōu)勢[16]。內毒素是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，檢測其血液濃度可以反映腸黏膜通透性和細菌入血情況[17-18]。判定心臟死亡后，腸道呈現(xiàn)淤紫狀態(tài)、彈性較差，黏膜上皮部分脫落，絨毛萎縮，固有層大量炎性細胞浸潤，血清學指標均大幅升高，整體表現(xiàn)顯示腸道經(jīng)歷嚴重的缺血缺氧后導致炎性反應和腸上皮細胞及結構損傷。ECMO 運行2 h和4 h 的檢測結果顯示腸黏膜組織病理相比心臟死亡后均有不同程度好轉，黏膜上皮壞死脫落減輕，絨毛排列大致規(guī)則，炎性細胞浸潤明顯減少，內毒素、DAO 和I-FABP 隨時間延長有逐漸下降趨勢。ECMO 運行能夠為腸道提供充足的氧氣和營養(yǎng)，維持腸道的生理溫度，有利于腸黏膜上皮細胞的恢復，保護黏膜屏障功能。ECMO 運行6 h 后，腸壁水腫、變薄，腸蠕動減弱，腹腔滲出增多，黏膜固有層炎細胞大量浸潤，血清內毒素和DAO 變化不明顯，I-FABP 從前4 h 的逐漸下降趨勢轉為快速上升，綜合以上結果提示腸黏膜屏障功能沒有得到持續(xù)保護，反而有惡化趨勢。在本實驗的預實驗中，ECMO運轉超過6 h 后，因腹腔滲出增多，通過補液升壓等措施后，流量仍難以維持，腹腔臟器顏色和質地明顯變差，ECMO 體外灌注的目的是保護和支持臟器功能，因此實驗沒必要繼續(xù)延長ECMO 運行時間來觀察腸黏膜屏障功能變化。

ECMO 作為一種中短期心肺替代輔助治療技術，可以為DCD 供體提供有效的血液灌注和氧供，短期運行對腸道具有保護支持作用，維護黏膜屏障功能，減少菌群異位及毒素入血，為其他腹腔臟器修復提供良好的循環(huán)微環(huán)境。但同時，ECMO 作為一種侵入性技術，能激活炎癥反應，本實驗證實長時間運行ECMO 會引起腸黏膜屏障功能的進一步損傷，炎癥反應嚴重，可能成為移植術后相關并發(fā)癥的潛在使動因素，因此有待進一步研究。本實驗為今后ECMO 對DCD 供體器官的損傷修復機制和腸道功能損傷相關性研究提供新的思路和依據(jù)。