口服蛋氨酸飼料致大鼠心室重塑的研究

涂代苗，闞晨星，馬向紅

（天津醫科大學第二醫院心臟科，天津市心血管病離子與分子機能重點實驗室,天津心臟病學研究所，天津300211）

心力衰竭是許多心血管疾病的終末階段，嚴重影響患者的生存。人口老齡化和其他心血管疾病生存率的提高使心力衰竭的發病率增加[1]。目前認為，心室重構是心力衰竭發生、發展的重要機制[2]。心室重構是各種原因導致心臟結構和（或）功能的改變，其機制十分復雜，除了代償機制外，心肌細胞的氧化應激損傷、免疫和炎癥改變，能量利用障礙、神經體液調節失衡，細胞因子表達異常等因素的互相影響也參與其中。

同型半胱氨酸（HCY）是蛋氨酸代謝的中間產物，與冠心病、高血壓等發病密切相關[3]，也與心力衰竭的嚴重程度（NYHA 分級）相關[4]。HCY 既是心力衰竭的危險因素，也是判斷心力衰竭患者預后的預測因子。筆者先前的研究表明HCY 致動脈粥樣硬化機制主要與內皮細胞損傷、平滑肌細胞增生、氧化應激和炎癥反應有關[5]。近年研究提出，同型半胱氨酸引起心力衰竭的機制除了與血管機制有關，還可以直接引起心肌損傷，導致心肌肥大、心肌細胞凋亡和間質纖維化，引起心肌重塑[6]。程序性細胞死亡蛋白 4（programmed cell death protein 4,PDCD4）是一種抑癌基因，有促進細胞凋亡的作用，研究發現PDCD4 在心肌纖維化中呈低表達。本研究通過口服蛋氨酸飼料構建高HCY 大鼠模型，探索HCY致大鼠心臟功能的變化，以及引起大鼠心室的病理改變及PDCD4 信號通路在其中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5 周齡健康雄性Wistar 大鼠30 只，體質量（200± 20）g，清潔級，購自北京華阜康公司，適應性喂養1 周后，隨機分為對照組15 只，實驗組15 只。對照組予普通飼料喂養，不做特殊處理；實驗組予3%蛋氨酸飼料喂養。各組均不定量按需給食，250 mL 飲水瓶每日換水，每周記錄體質量。

1.2 主要試劑及設備 HCY 酶聯反應試劑盒購自上海撫生生物公司，大鼠PDCD4（ab51495）單克隆抗體購自abcam 公司，GAPDH 單克隆抗體購自天津百倍生物科技公司，Vevo2100 小動物超聲儀，Biorad 電泳儀。

1.3 模型的制備及樣本的留取 各組大鼠分別喂養12 周后檢測心臟彩超，留取內眥靜脈血，4℃，2 000 rpm×20 min 離心制備血漿，處死動物，切取心室，稱體質量，用作組織學研究的心室用4%的中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，4℃保存、備用；其余-80℃保存后續用于分子研究。

1.4 血漿HCY 及NT-proBNP 測定 采用ELISA法測定已制備的血漿HCY 濃度，具體步驟為：（1）設計標準孔與樣本孔，標準孔加不同濃度的標準液50 μL，樣本每孔加樣 50 μL。（2）加入酶標試劑100 μL。（3）37℃溫育 60 min。（4）洗滌 5 次。（5）加入顯色劑 37℃避光 15 min。（6）終止反應。（7）測定，以450 nm 波長依序測定各孔吸光度。

1.5 心臟超聲的測量 3%蛋氨酸飼養12 周后，實驗組與對照組大鼠均進行超聲心動圖檢查。應用GE Vivid 7 型超聲儀，使用7.5 MHz 探頭對大鼠行心臟超聲檢查，應用Vevo 2100 小動物超聲系統用來測量分析，配備M-型超聲，B-型超聲和組織多普勒。大鼠采用異氟醚麻醉，仰臥固定，胸前備皮，于左側胸骨旁取左室長軸切面，連續記錄至少3 個心動周期，保存二維圖像，測定室間隔厚度（IVS）、左室收縮內徑（LVES）、左室舒張末徑（LVED）、左室后壁厚度（LVPW）、左室收縮期容量（LVSV），計算射血分數（EF%），縮短分數（FS%），所有測量數值取3次結果的平均值。

1.6 血流動力學指標的測定 取大鼠稱體質量，記錄，腹腔麻醉后仰臥固定，充分暴露手術區域。大鼠左側上肢、左右下肢通過尖端連接針穿刺皮下，另一端連接于血流動力學換能機器上，連續記錄肢體導聯心電圖。連接壓力傳感器管路系統，壓力傳感器系統血壓調零，于大鼠頸部正中做一縱行切口，鈍性逐層分離肌肉，暴露出一側的頸總動脈，動脈夾夾閉動脈近心端，傳入2 根001 號手術縫線，遠心端結扎，近心端打單節，用動脈剪剪開動脈管徑的1/3，將自制內徑為1.5 mm 聚苯乙烯心導管（導管內充滿含有肝素的氯化鈉注射液）通過切口插入右頸總動脈內，導管的另一端通過三通、用壓力換能器與BL-420S 生物機能試驗系統相連，隨后近心端縫線結扎固定動脈及導管，防止導管脫出，用鑷子夾住導管固定，再松開動脈夾，并將導管緩慢插入動脈內，計算機通過生物機能實驗系統，進入血流動力學模塊。此時波形為動脈血壓曲線，待血壓穩定1 min。截取10 個心動周期的心電圖及血壓，分別測量各種心電數據，分析測定HR、血壓測量主動脈收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張壓（LVDP）等。

1.7 HE 染色 每個標本選取3 張心肌石蠟切片進行HE 染色，用Olympus CX21FSI 光學顯微鏡留取心肌組織結構圖片。石蠟切片5 μm 厚，經過脫蠟、染色、脫水、透明、封固后光鏡觀察。

1.8 Masson 染色 每個標本選取3 張心肌石蠟切片按Masson 三色染色試劑盒說明進行染色。用Olympus CX21FSI 光學顯微鏡觀察心肌組織膠原纖維沉積的情況，每張切片在同一光照強度下，隨機選取5 個視野并在相同條件下拍照，應用Image pro plus 7.0 圖像分析軟件對組織切片進行圖像分析。

1.9 組織蛋白提取 剪取一小塊心室肌組織（50 g），放入研缽內，冰上研磨，加入RIPA 裂解液（500 μL）裂解 20 min，收集裂解液，4℃，12 500 r/min，離心20 min，取上清液。-80℃保存備用。

1.10 Western blot 法檢測PDCD4 的表達 配膠，每孔加樣品5 μL，經電泳，轉膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PDCD4 （1:5 000）一抗4℃孵育過夜后，TBST 洗 3 次，二抗室溫孵育 1 h，TBST 洗 3次，曝光。

2 結果

2.1 兩組大鼠一般情況及體質量的測定 隨機分組后，每周記錄大鼠體質量，可見3%蛋氨酸飼料喂養組大鼠約1 個月后出現體質量增長緩慢。并且，實驗組大鼠出現萎靡不振，毛發無光澤，進食減少表現，個別出現體質量不增長或負增長（圖1）。

圖1 時間-體質量增長曲線Fig 1 Time-weight growth curve

2.2 血漿HCY 與NT-proBNP 結果 3%蛋氨酸喂養組大鼠血漿HCY 濃度明顯高于對照組大鼠[（5.62±0.44）μmol/L vs.（13.25±0.57）μmol/L]，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），圖2 為標準曲線。

圖2 HCY 測量標準曲線Fig 2 Standard curve of HCY

2.3 心臟超聲 經過統計后發現實驗組大鼠的射血分數，縮短分數，室間隔厚度減低，左室收縮末徑及左室舒張末徑增加。左室收縮期末內徑[（3.86±0.64）vs.(4.88±0.41)，P＜0.05]，舒張期末內徑增高[（6.79±0.50）vs.(7.45±0.62)，P ＜0.05]，射血分數[（72.76±7.30）vs.(61.68±5.72)，P ＜0.05]，縮短分數[（43.40±6.60）vs.(34.45±4.32)，P＜0.05]，室間隔厚度降低[（1.76±0.26）vs.(1.35±0.07)，P＜0.05]，圖3、4。

圖3 M 型超聲心動圖Fig 3 Representative M-mode echocardiography image of the ventricle

圖4 心臟超聲指標結果比較Fig 4 Comparison of echocardiographic index between two groups

2.4 血流動力學結果 血流動力學指標顯示，3%蛋氨酸組大鼠SBP 和DBP 較對照組降低（P＜0.05）LVSPLVDP、HR 等在兩組中無差異，見表 1。

表1 兩組大鼠血流動力學對比Tab 1 Comparison of hemodynamic parameters between two groups

2.5 病理 各組分別喂養12 周后，取大鼠心室肌組織進行固定，切片，HE 染色光鏡下可見，對照組大鼠心肌細胞排列有序、胞漿均勻，心肌間隙小；實驗組大鼠心肌組織排列紊亂，大小不均，組織間隙增大（圖5）。Masson 染色顯微鏡下觀察到，與對照組相比，實驗組大鼠心肌間質纖維化明顯，纖維組織增生顯著，可見大量被染成藍色的膠原纖維呈條索狀廣泛分布。計算兩組大鼠心室組織膠原容積分數，結果顯示實驗組大鼠心肌組織膠原分數較對照組升高，有統計學意義（圖6）。

圖5 心肌組織HE 染色（20×）Fig 5 HE staining of ventricular tissues（20×）

圖 6 心肌 Masson 染色（20×）Fig 6 Masson staining of ventricular tissues（20×）

2.6 蛋白定量實驗 Western 印跡實驗顯示，蛋氨酸喂養大鼠PDCD4 表達上調，見圖7。

圖7 PDCD4 蛋白表達量Fig 7 Expression of protein PDCD4

3 討論

心力衰竭即心臟難以泵出足夠的血液以滿足機體對血液和氧氣的需求而導致機體出現相關癥狀與體征的復雜的臨床綜合征。為多種心血管疾病的終末階段，其發病率高,有臨床癥狀患者的5 年存活率與惡性腫瘤相仿。近期心力衰竭的發病率持續增長,正在成為21 世紀最重要的心血管病癥[7]。據統計, 人群中心力衰竭的患病率約為1.5%～2.0%，65歲以上可達6%～10%；在過去的40 年中，心力衰竭導致的死亡增加了6 倍[7]。冠心病、心肌梗死、心律失常、心肌病、心瓣膜病以及代謝性疾病等都可導致心力衰竭的發生。心肌細胞死亡影響心室的收縮功能，纖維化程度的增加導致心室舒張功能的下降，心功能受損、心腔擴大進而導致心室重構，最終發展為心力衰竭。

為了尋求心力衰竭的治療，以往的研究構建了多種動物模型，多以增高心臟前后負荷，或通過缺血性心肌病，心臟快速起搏，或直接損傷心肌的藥物如蒽類抗癌藥物來模擬心力衰竭[8-10]。尚無成熟的代謝性疾病導致心力衰竭的動物模型建立，HCY 是多種心血管疾病的危險因素[4,11-12]。隨著生活水平的提高，蛋白質攝入增多，中國人群的血HCY 水平較高[13]，高HCY 血癥的總體患病率高達27.5%，而中國人群中不僅葉酸缺乏比例增高，MTHFR 基因突變比例較高，單純補充葉酸水平可能難以降低血HCY 水平[14-15]。故模擬高HCY 導致心力衰竭模型，研究其對心室重塑的作用機制，尋求心力衰竭的新的治療手段，十分有必要。有研究表明高HCY 血癥可致大鼠心力衰竭[16]。且有實驗應用蛋氨酸喂養大鼠構建高HCY 血癥模型[17-20]，但應用蛋氨酸喂養構建大鼠心力衰竭模型尚未得到廣泛驗證與認可。筆者通過喂養3%蛋氨酸飼料構建心力衰竭模型，證實蛋氨酸喂養組血漿HCY 濃度明顯高于對照組[（5.62±0.44）μmol/L vs（13.25±0.57）μmol/L，P＜0.05]，與 Liu 等[16]實驗中的 HCY 測量值有差異（HCY＞20 μmol/L），可能與喂養時間、采血時間不同有關。大鼠的超聲心動圖結果趨勢與Liu 實驗中大鼠心功能改變的趨勢相似，兩組間差別存在統計學意義，故可以認為高蛋氨酸喂養大鼠心肌重塑模型成功，之后筆者通過HE 染色和Masson 染色證實了HCY對大鼠心肌的病理損害，可見實驗組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞肥大，組織疏松，心室肌纖維化明顯。經過蛋白定量實驗證實蛋氨酸飼料喂養組大鼠的心室肌PDCD4 蛋白表達下調，表明蛋氨酸飼料喂養大鼠導致的高HCY 血癥對心肌細胞的直接損傷可能是通過下調PDCD4 所致。

總之，筆者發現蛋氨酸在體內轉化為HCY 后可直接作用于心肌，損傷心功能，其機制可能與下調PDCD4 通路有關，調控PDCD4 通路表達，可能成為心力衰竭治療的新方向。