原肌球蛋白的重組表達、鑒定及與免疫球蛋白E 結合能力分析

劉甫，李軍普，李紹深，李智偉，孔德玉，白虹，李會強

（1.天津醫科大學醫學技術學院，天津300203；2.天津市中醫藥研究院附屬長征醫院檢驗科，天津300120；3.天津市港口醫院檢驗科，天津300456；4.天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津300070）

貝類是導致食物過敏的主要原因之一，在食物過敏患者中的流行率為2.8%～8.0%[1]。隨著近些年來貝類消費量的不斷增加，免疫球蛋白E（IgE）介導的貝類過敏對兒童和成人造成的健康威脅日益嚴重。

目前關于貝類過敏的實驗室血清學診斷包括基于食物粗提物（包括過敏原組分與非過敏原組分）作為抗原的檢測和基于純化或者重組過敏原作為已知抗原的分子診斷[2]。分子診斷可以明確致敏蛋白，提高診斷特異性，并且某些過敏原與臨床過敏癥狀的嚴重性相關，因此，這種診斷方法具有顯著優勢[3]。目前已明確的貝類過敏原有15 種[4]。由于部分過敏原組分在其來源中含量降低，并且純化過程易受其他組分的干擾，通過提取純化的方式獲得單個過敏原蛋白往往難以實現。而過敏原重組表達技術可以高效的獲取足量的單一目的蛋白，已被廣泛應用[5-6]。

此外，一些貝類過敏人群僅對單一過敏原組分敏感，而另一些患者則對多種組分同時敏感[7]。這些不同的過敏原識別模式對貝類提取物在過敏原特異性免疫治療（allergen-specific immunotherapy，AIT）中的安全性和有效性產生了一些限制。重組過敏原與其天然組分類似，但具有穩定的質量和無限量的產量等優點，便于選擇符合條件的患者和適合的過敏原進行AIT 脫敏治療，從而使這一領域朝著更有效的治療效果、更少的不良反應的方向發展[5]。

原肌球蛋白（Pen a 1）是貝類動物中的主要過敏原組分。本研究中筆者成功表達、純化出有良好免疫學活性的重組Pen a 1，為進一步研究Pen a 1在貝類動物過敏的診斷和治療中作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 限制性內切酶Bam HⅠ和HindⅢ（美國 NEB 公司），DNA 連接酶（美國 NEB 公司），質粒提取試劑盒、PCR 凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）LB 培養基（上海生工生物工程有限公司），Ni-NTA 純化系統、長臂生物素（美國ThermoFisher Scientific 公司），抗人 IgE 抗體（美國Sigma-Aldrich 公司），鏈霉素標記的感光球、裸的發光球（北京科美生物公司）。

1.2 血清樣本 收集天津市中醫藥研究院附屬長征醫院和天津市港口醫院 2018 年1 月-9 月共63例臨床血清樣本，分別來自35 例貝類過敏患者和28 名健康志愿者。IgE 介導的貝類過敏的診斷按照歐洲變態反應與臨床免疫學學會（European Academy of Allergy and Clinical Immunology, EAACI）指南推薦的以下診斷標準做出, 即基于與貝類攝入相關的嚴重和/或急性過敏反應等明確的臨床病史，以及血清貝類特異性IgE＞0.35 kUA/L（ImmunoCAP 系統，Phadia）。如果無臨床貝類過敏病史且血清貝類特異性IgE＜0.35 kUA/L，則為陰性血清樣本，作為對照。患者入組前均獲得書面知情同意。本研究經天津醫科大學倫理委員（TMUHMEC2017008）批準，按照《赫爾辛基宣言》的原則進行。

1.3 Pen a 1 基因的合成 由于Pen a 1 序列（GenB ank No.DQ 151457）已知，委托通用生物系統（安徽）有限公司人工合成目的基因。目的基因合成后，通過PCR 擴增初步驗證其片段大小。根據Pen a 1序列設計合成特異性引物，上游引物為5′-ACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGG CCAT CAAGAAGAAGAT-3′,下游引物為 5′-CTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGC TTTTAGTAGCCAGACAGTTCGCTG-3′。將合成的引物和目的基因配制成混合液作為反應模板，加入DNA 聚合酶、dNTP 配制成PCR 反應體系，進行PCR 擴增并鑒定PCR 擴增結果。

1.4 重組表達質粒pET-28a (+)-Pen a 1 的構建 首先目的基因Pen a 1 與載體pET-28a(+)分別用限制性內切酶Bam HⅠ和Hind Ⅲ雙酶切；然后進行核酸電泳，凝膠回收；最后在DNA 連接酶的作用下，目的基因Pen a 1 與載體pET-28a (+)進行連接，從而構建重組表達質粒pET-28a（+）-Pen a 1。將構建好的重組質粒轉化至感受態Top10 中，涂布相應抗性瓊脂平板。培養過夜后，平板挑菌，37℃250 r/min 搖菌16 h，用菌液進行PCR 鑒定，并將陽性克隆菌液送測序。測序比對正確的質粒，進一步進行Bam HⅠ-Hind Ⅲ雙酶切驗證。

1.5 重組過敏原蛋白Pen a 1 的表達、純化 通過熱休克轉化法，將獲得含Pen a 1 編碼區和組氨酸親和純化標簽（6His）的重組質粒轉化到大腸桿菌BL 21（DE3）中，并涂布含卡那霉素瓊脂平板。培養過夜后，平板挑菌至LB 菌液培養基。當培養基在600 nm 處的光密度值（OD）達到 0.4～0.6 時，添加終濃度為 1 mmol/L 的 IPTG，在 37℃，220 r/min 的條件下誘導表達3 h。4℃環境中4 000×g 離心5 min，收集菌液沉淀，PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）重懸，超聲裂解菌體，離心取上清進行蛋白電泳。根據Ni+-NTA 親和層析說明書，對裂解液上清進行純化，獲得單一的重組蛋白。為進一步驗證該蛋白，蛋白電泳、切膠回收后，送至上海生工生物工程有限公司進行質譜鑒定。

1.6 重組過敏原蛋白Pen a 1 的免疫學活性評估 血清過敏原特異性IgE（sIgE）檢測采用光激化學發光均相法（light-initiated chemiluminescent assay,LICA）。LICA 基于納米粒子對的形成和發光氧通道免疫分析技術。研究表明，該方法具有靈敏度高、分析范圍廣、周期快、無需洗滌等優點，適用于血清過敏原sIgE 的檢測[8]。首先參照生物素試劑說明書中的標準程序，將重組過敏原Pen a 1 標記生物素。同時依據已有文獻中的標記流程[8]，將抗人IgE 與發光球表面帶有的化學基團共價連接，制備抗人IgE標記的發光球。

然后在96 孔板中依次加入25 μL 用含有1%人血清白蛋白（HSA）的 PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）稀釋（1:20）的血清樣品，50 μL（1:1 000，稀釋液：PBS/HSA）抗人IgE 抗體標記的發光球和1 μg/L 的生物素化Pen a 1 溶液，37℃震蕩孵育30 min。隨后，加入150 μL 鏈霉親和素標記的感光球，反應混合物在37℃避光條件下震蕩孵育10 min。最后，在LICA儀器上檢測化學發光信號（chemiluminescence，CL），信號值單位用相對光單位（relative light units, RLU）表示。同時將健康人血清平行處理作為陰性對照。每份血清樣本復孔檢測。

2 結果

2.1 Pen a 1 基因的PCR 擴增鑒定 根據Pen a 1已知序列，設計上下游引物，將合成的目的基因經PCR 擴增、瓊脂糖凝膠電泳后，如圖1 所示，所得目的片段的大小約為930 bp（加上保護堿基及酶切位點），與理論預測值相符。

圖1 原肌球蛋白（Pen a 1）PCR 擴增Fig 1 PCR amplification of the tropomyosin Pen a 1

2.2 重組表達質粒pET-28a (+)-Pen a 1 的驗證 將目的基因與質粒載體酶切連接后，構建重組表達質粒pET-28a (+)-Pen a 1。部分樣品的菌落PCR 結果如圖2A 所示，PCR 擴增出的目的基因大小約為930 bp，與預測的片段大小930 bp 相符，說明目的基因成功連接到質粒載體上。同時陽性克隆菌的正向與反向測序結果顯示所得序列與NCBI 上所公布的Pen a 1 序列一致。此外將測序正確的菌落搖菌培養，提取質粒并進行雙酶切，獲得的條帶約 867 bp、5 400 bp 與預期 867 bp、5 400 bp 的大小一致，見圖2B。酶切結果表明獲得了含Pen a 1基因的重組質粒。

圖2 重組表達質粒pET-28a(+)-Pen a 1 的驗證Fig 2 Verification of recombinant expression plasmid pET-28a(+)-Pen a 1

2.3 目的蛋白的表達、純化及及鑒定用1 mmol/L IPTG誘導培養，在37℃，220 r/min 條件下表達3 h，SDSPAGE 電泳結果顯示（圖3A）在36 kD 處出現一條明顯增多的蛋白條帶，分子量與預測值相符，且未誘導的菌體中未明顯出現該條帶。該目的蛋白主要出現在超聲波處理后的上清液中產生，所以為可溶性表達。鎳柱純化后，SDS-PAGE 電泳結果顯示（圖3B）獲得了單一純化的目的蛋白。此外經進一步質譜鑒定（表1），該目的蛋白為原肌球蛋白。

2.4 血清IgE 抗體與原核表達產物Pen a 1 的結合能力 采用LICA 技術檢測重組Pen a 1 過敏原結合貝類過敏患者血清IgE 抗體的結合能力。如圖4 所示，71.4%（25/35）的患者血清sIgE 抗體對重組Pen a 1 過敏原敏感，與已有的文獻報道類似，說明該重組過敏原具有來良好的過敏原性。

圖3 目的蛋白的表達、純化Fig 3 Expression and purification of the Pen a 1 allergen

表1 重組過敏原Pen a 1 質譜鑒定Tab 1 Identification of recombinant tropomyosin Pen a 1 by MS/MS and Mascot database searches

用LICA 檢測貝類過敏血清抗體與 Pen a 1 結合反應性（n=35）。作為陰性對照，健康人血清同時也被檢測（n=28）。如果過敏血清的CL 值高于以水平線表示的通過將兩個標準偏差（SD）與陰性對照的平均CL 值相加而確定的截斷值（Cutoff Value =Mean+2SD），則被認為反應陽性。

圖4 重組過敏原Pen a 1 與血清sIgE 結合能力Fig 4 The ability of recombinant tropomyosin Pen a 1 binding to serum sIgE

3 討論

由于重組過敏原有可能克服天然過敏原提取物在診斷與脫敏免疫治療中的缺點，目前許多過敏原已蛋白已被克隆、測序和表達[9-12]。本研究中，根據Pen a 1 已知序列，筆者人工合成了其目的基因，然后與載體pET-28a(+)酶切連接，構建重組表達質粒pET-28a(+)-Pen a 1。用IPTG 處理誘導轉化的大腸桿菌BL21 表達該重組蛋白。通過SDS-PAGE 檢測目的蛋白質表達，得到與預計的分子量匹配的單一特異性條帶。進一步的質譜分析鑒定結果證實了重組融合蛋白與Pen a 1 過敏原一致。因此，筆者成功構建了pET-28a(+)-Pen a 1 融合表達載體，并在大腸桿菌中成功表達。

Pen a 1 是貝類動物中被發現的第一個主要的過敏原，并且在13 個不同物種中被WHO/IUIS 確定和登記為過敏原[2]。同時Pen a 1 也被認為是主要的泛過敏原，介導甲殼類與其他節肢動物如塵螨或者蟑螂之間的交叉反應性[13-14]。研究表明，在蝦攝入后的相關過敏反應診斷中，蝦原肌球蛋白sIgE 的檢測優于基于商業粗提物的皮膚點刺試驗和蝦sIgE 的測定[15]。目前過敏原單組分Pen a 1-sIgE 的測定以重組過敏原Pen a 1 作為已知抗原，采用熒光免疫分析（ImmunoCAP system； Phadia, Uppsala, Sweden）[16]，但相關試劑及設備尚未被國內引進。因此本次研究所得的目的蛋白可以作為檢測原料，依托國產檢測平臺（LICA 技術）將有助于本地區過敏人群的精準診斷。

目前對海鮮過敏的治療策略在本質上大多是姑息性的，即避免攝入致敏食物，強調了對食物進行標簽和檢測海鮮過敏原的必要性[2]。研究認為AIT是唯一能改變過敏性疾病（如過敏性鼻結膜炎和哮喘）自然病程的病因治療[17]。但是天然的過敏原提取物在過敏原含量上往往表現出很大的差異，可能缺乏重要的過敏原，并且可能被其他來源的過敏原污染。相反，重組技術可以生產生物活性充分表征的、純度高、未污染的疫苗組分。此外，基因工程技術可以對野生型過敏原進行修飾，以產生具有低IgE 反應性的過敏原衍生物（“低過敏原”），降低在AIT 過程中引發不良過敏反應的風險，并保留免疫原活性[18]。同時在研究貝類過敏的免疫學機制以及加熱對過敏原蛋白的影響中，也常常利用重組過敏原[19-20]。原肌球蛋白作為貝類過敏人群的主要致敏原，其重組表達形式優于有天然提取物，有助于貝類過敏人群的AIT 治療及其他機制研究。

綜上，本次研究為進一步研究重組Pen a 1 在變態反應診斷和治療中的應用提供了基礎。