光激化學發光分析法定性檢測血清CMV-IgM 抗體

劉浩，李軍普，崔亞瓊，于洋，張月香，李會強

（1.天津醫科大學醫學檢驗學院，天津300203；2.天津市中心婦產科醫院檢驗科，天津300100）

巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）是孕前或孕早期TORCH 檢測重要指標之一[1]。CMV 是引起全世界先天性和圍產期感染的重要病原體。CMV 感染通常是無癥狀的，但在免疫功能不全的患者以及通過胎盤傳染的胎兒，它的發病率和死亡率會顯著提高。孕婦在懷孕初期前3 個月內首次感染CMV可能導致胎兒流產、死胎、畸形[2]；新生兒先天性CMV 感染可能導致新生兒黃疸、肝脾腫大、皮膚瘀點、感音神經性聽力損失、宮內發育遲緩，甚至死亡[3]。因此，產前篩查CMV 感染有助于優生優育、發病風險評估以及后期抗病毒治療。目前國內TORCH 的實驗室檢測方法主要為血清學檢測和病毒核酸檢測，其中血清學檢測IgM 抗體已作為初步診斷早期感染的重要依據和流行病學的篩查，廣泛應用于臨床[4]。

迄今為止，國內外已開展多種檢測CMV-IgM抗體的實驗室方法，包括膠體金免疫層析法、熒光免疫分析法、酶聯免疫檢測法、化學發光免疫分析法等。其中膠體金免疫層析法操作簡單、快速，但靈敏度較低；熒光免疫分析法特異性較高，但試劑所需費用昂貴，不適合大規模篩查；酶聯免疫檢測法是臨床最常見的一種方法，靈敏度較高，但操作步驟繁瑣、耗時較長；化學發光免疫分析法發展至今已逐漸替代其他方法，成為實驗室檢測CMV-IgM抗體的主要方法，具有快速、靈敏度高，易于自動化等特點，雖日漸成熟，但操作仍繁瑣，需多次分離和洗滌過程，提高了結果出錯的概率。光激化學發光分析法（light initiated chemiluminescent assay, LiCA）是一種新型均相檢測技術[5]，此方法無分離和洗滌過程，目前尚無LiCA 檢測IgM 抗體的相關報道。本研究旨在探索一種新的基于LiCA 技術的CMVIgM 抗體檢測方法，建立一套完善的檢測體系，并進行方法學評價和臨床結果比對。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 實驗所用臨床標本均取自天津市中心婦產科醫院產前篩查婦女和孕早期婦女。共210 例血清樣本，其中40 例陽性和70 例陰性血清樣本由雅培ARCHITECT 化學發光免疫分析儀兩次檢測確定，100 例血清來自隨機產前篩查婦女。所有血清樣本分裝并保存于-80℃。

1.2 主要試劑 CMV（pp150, pp65, pp52）重組抗原購自廈門萬泰滄海生物公司；鼠抗人IgM 抗體購自英國ABcam 公司；長臂活化生物素（Sulfo-NHSLC-Biotin） 購自美國 Pierce 公司；發光微球（chemibead, CB）與鏈霉親和素（streptavidin, SA）包被的感光微球（sensibead, SB）由北京科美生物公司提供。

1.3 儀器 LiCA 分析儀器購自上海博陽生物公司。

1.4 發光微球的包被 分別用抗人IgM 抗體和CMV 抗原包被發光微球。參考使用說明書，取2 mg發光微球于0.1 mol/L pH 6.0 的2-嗎啉乙磺酸（MES）緩沖液中離心洗滌，將抗體/抗原與處理過的發光微球以質量比20:1 混合于0.1 mol/L pH 6.0 的MES 緩沖液中，所得混合溶液再與25 mg/mL 氰基硼氫化鈉（NaBH3CN）以體積比25:1 于37℃避光48 h，之后用0.1 mol/L pH 6.0 的MES 緩沖液反復離心洗滌3 次，使抗體/抗原包被于發光微球，并調節其濃度為10 mg/mL。

1.5 生物素的標記 分別用生物素標記抗人IgM抗體和CMV 抗原。根據參考文獻[6-7]，取生物素于二甲基甲酰胺溶液中進行溶解，將抗體/抗原于0.1 mol/L pH 8.0 的 Na2CO3/NaHCO3緩沖液中充分透析，然后取處理過的生物素和抗體/抗原以摩爾比20:1 混合于37℃攪拌1 h，最后于4℃條件下在0.1 mol/L pH 7.4 的PBS 緩沖液中透析24 h，去除游離生物素，獲得生物素化（biotinylation，Bio）抗體/抗原。

1.6 檢測模式 對CMV-IgM 抗體而言，有兩種分析模式可供選擇[8-9]，分別是捕獲二抗模式和固相抗原模式，前者稱為捕獲法，后者稱為間接法，檢測原理見圖1。具體檢測步驟如下：捕獲法中于微孔依次加入 15 μL 稀釋血清，25 μL CB-抗人 IgM 抗體，25 μL Bio-CMV 抗原（圖1A）；間接法中依次將15 μL 稀釋血清，25 μL CB-CMV 抗原，25 μL 的Bio-抗人IgM 抗體加入微孔（圖1B）；然后將微孔板37℃孵育17 min，避光條件下加入175 μL SB-SA，37℃孵育15 min，孵育完成后，用LiCA 分析儀器讀取CB-SB 偶聯后產生的光信號。

1.7 條件優化 對反應體系中的緩沖液、抗原濃度、抗體稀釋比例和血清稀釋比例進行優化。

1.8 臨界指數 檢測收集來的50 例陽性和60 例陰性血清樣本，將檢測結果進行ROC 曲線分析。曲線下面積（AUC）范圍為 0.5～1.0，一般情況下 AUC＞0.9時表示該方法具有較高的診斷性能[10]。間接法LiCA采用定性檢測CMV-IgM 抗體，實驗結果以樣本信號值/臨界信號值（S/Co）表示。

1.9 方法學評價

圖1 捕獲法（A）和間接法（B）CMV-IgM 抗體檢測原理示意圖Fig 1 Schematic diagram of the capture（A）and indirect（B）formats for detecting CMV-IgM antibody on LiCA

1.9.1 精密度 當批內變異系數（CV）＜10%，批間CV＜20%時，表明實驗精密度為可接受。準備陰性、弱陽性、強陽性3 個水平的混合血清樣本，每個血清在同一天相同條件下重復檢測10 次，計算反應批內CV；每個血清做副孔在相同條件下連續檢測10 d，計算反應批間CV。

1.9.2 特異性 為評價其他IgM 抗體對CMV-IgM抗體檢測的影響，利用本實驗建立的方法分別對5份弓形蟲、5 份風疹病毒、5 份單純皰疹病毒和5份類風濕因子IgM 抗體陽性的血清進行檢測。

1.9.3 檢測結果比對 分別用本實驗建立的間接法LiCA 與意大利索靈公司LIAISON 化學發光免疫分析儀對100 例臨床血清樣本進行檢測。

1.10 統計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。對LiCA 與LIAISON 檢測結果進行Kappa一致性檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 確定檢測模式 從圖2A 中能明顯看出，捕獲法中兩組樣本的光信號值沒有顯著差別，不能正確區分陽性樣本和陰性樣本；而如圖2B 所示，在間接法中兩組樣本的光信號值相差較大，陽性樣本和陰性樣本區分明顯；并且間接法的總CMV-IgM 抗體陽性信號值/陰性信號平均值（P/N）比值高于捕獲法（圖2C）。因此，本實驗的最終檢測模式為間接法。

圖2 捕獲法和間接法比對結果Fig 2 Comparison of the results between capture and indirect formats

2.2 條件優化

2.2.1 緩沖液 準備4 種緩沖液，緩沖液A：0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液、0.3 mol/L NaCl 溶液、10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）；緩沖液 B：10 mmol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖液；緩沖液C：0.1 mol/L pH 6.0 MES 緩沖液、10 mg/mL BSA；緩沖液 D：0.02 mol/L pH 8.0 Hepes 緩沖 液 、0.15 mol/L NaCl 溶 液 、0.03 mg/mL BSA。利用4 種緩沖液分別檢測4 個不同濃度的陽性混合血清和20 例陰性血清，通過對P/N 比值的比較選出反應最優緩沖液。如圖3A 所示，在使用緩沖液A 時4 個陽性混合血清的P/N 比值均最高；進一步優化緩沖液A，向其中加入了一種表面活性劑-0.01% 吐溫-20，結果顯示添加了吐溫后的總P/N 高于不添加的（圖3B）。因此，實驗最終緩沖液為0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液、0.3 mol/L NaCl 溶液、0.01% 吐溫-20 和 10 mg/mL BSA。

圖3 緩沖液對檢測結果的影響Fig 3 Effect of different buffers on the testing results

2.2.2 工作濃度 將CB-CMV 抗原稀釋至1.25、2.50、3.75、5.00 μg/mL，如圖4A 所示，保持其他條件不變，低、中、高3 個水平的陽性混合血清在CBCMV 抗原濃度為 2.50 μg/mL 時 P/N 達到了最大值，實驗開始出現鉤狀效應。將Bio-抗人IgM 抗體倍比稀釋至1:500，1:1 000 和1:1 500，保持其他條件不變，3 個水平的陽性血清在Bio-抗人IgM 抗體稀釋比例為1:500 時P/N 最大（圖4B）。因此，本實驗最終 CB-CMV 抗原濃度為 2.50 μg/mL，Bio-抗人IgM 抗體稀釋比例為1:500。

在 CB-CMV 抗原濃度為 2.50 μg/mL，Bio-抗人IgM 抗體稀釋比例為1:500 的條件下，將待檢血清樣本倍比稀釋至 1:100、1:200、1:400 和 1:800。結果（圖4C）顯示P/N 比值隨著血清稀釋比例的增加而增加，直至達到1:400 開始下降。因此，本實驗選擇1:400 作為待檢血清稀釋比例。

圖4 各組分稀釋比例對檢測結果的影響Fig 4 Effect of different dilution ratio of each component on the testing results

2.3 最佳臨界指數 如圖5A 所示，AUC 為0.997（95% CI: 0.992~1.002），此時臨界值為 5819 cps，靈敏度為97.1%（95%CI:0.901~0.997），特異度為100%（95% CI: 0.912~1.000）。當 IgM（S/Co）為 1.45 時，特異度達到了最大，為100%（95% CI: 0.961~1.000），此時的靈敏度較低，為92.5%（95%CI:0.796~0.981）。當IgM（S/Co）為1 時，靈敏度達到最大值，為100%（95% CI: 0.912~1.000），此時的特異度也較高，為98.9%（95%CI:0.941~0.999）。故當 IgM（S/Co）＜1 時，樣本可視為陰性，當IgM（S/Co）≥ 1 時，樣本可視為陽性（圖5B）。

圖5 臨界指數的選擇Fig 5 Selection of cutoff value

2.4 方法學評價

2.4.1 精密度 如表1 所示，本實驗的批內CV 分別為5.9%，6.1%，5.3%；批間 CV 略高，分別為9.8%，9.7%，6.9%。

表1 LiCA 檢測CMV-IgM 抗體的精密度結果Tab 1 Precision for detecting CMV-IgM antibody on LiCA

2.4.2 特異性 檢測結果均為陰性，結果表明弓形蟲、風疹病毒和類風濕因子與本實驗CMV-IgM 抗體的檢測無交叉反應。

2.4.3 檢測結果比對 如表2 所示，相對于LIAISON，間接法LiCA 的總體符合率為95%，陽性符合率為92.5%（37/40），陰性符合率為96.7%（58/60），靈敏度為94.9%（37/39），特異性為95.1%（58/61）。一致性檢驗，Kappa=0.895，P＜0.01。

表2 兩種方法檢測結果比對Tab 2 Comparison of LiCA and LIAISON

3 討論

CMV-IgM 抗體是產前篩查CMV 感染的常用血清學指標。本實驗探索了一種基于LiCA 技術定性檢測血清CMV-IgM 抗體的新方法。LiCA 是一種由光激發的均相免疫分析技術，最早起源于20世紀90 年代的魯米諾氧通道免疫法[11]。具有免洗滌、免分離、高通量、靈敏度高、易使用、易于自動化、成本低等優勢[12-14]。其核心在于發光微球和感光微球在距離200 nm 時的化學能量傳遞，感光微球在680 nm 激發光的作用下，將周圍的氧氣轉化為單線態氧，單線態氧會將能量傳遞到相聚200 nm 范圍內的發光微球上的化學發光物質，使其在520～612 nm處產生光信號；當兩者相聚超過200 nm，單線態氧將衰變到基態氧并進入下一個能量循環[15-16]。

在本研究中，相較于捕獲法分析模式，采用Li-CA 間接法分析模式，待檢抗體優先與感光微球表面的抗原結合，游離于液相中的抗人IgM 抗體更能夠抵抗待檢血清標本中其他IgM 抗體的干擾。本方法的AUC 為0.997，表明該方法能較好的區分樣本的陰性和陽性，具有較高的診斷性能。批內和批間CV 均＜10%，表明該方法具有良好的重復性；與弓形蟲、風疹病毒和類風濕因子均無交叉反應，證明該方法具有較高特異性；與LIAISON 相比，總體符合率為95.0%，陽性符合率為92.5%，陰性符合率為96.7%，靈敏度為94.9%，特異性為95.1%，經一致性檢驗，Kappa=0.895，P＜0.01，說明該方法與 LIAISON之間具有較好的一致性，具有潛在的臨床應用前景。此外，在 LiCA 技術中，1 μg 化學微球包含 2×108微球，在680 nm 激發光的作用下，每個感光微球每秒均可釋放60 000 個單線態氧，如此強的信號放大使得LiCA 具有較高靈敏度[17]。本研究利用LiCA 高靈敏度的特點，將血清進行兩次20 倍稀釋，降低血清中總IgM 抗體濃度的同時有效削弱了非特異性IgM抗體對檢測的干擾，而LiCA 的高靈敏度，使得LiCA體系仍具有檢測低濃度CMV-IgM 抗體的能力。

以上實驗結果表明本研究初步建立的LiCA 檢測CMV-IgM 抗體的方法具有良好的分析性能。此外，該檢測體系還具有很多其他優點，如無洗滌和分離步驟，減少了因分離洗滌過程帶來的誤差；全程共需32 min，整個過程操作簡單，快速；實驗僅需15 μL稀釋血清，樣本用量較少；試劑穩定性高，成本低，易配制；易實現商業化和自動化,適合大規模篩查等。

本研究成功建立了LiCA 間接法分析模式檢測CMV-IgM 抗體，改善了傳統方法干擾因素多，時間長，過程繁瑣等缺點，實現了均相、免分離、免洗滌檢測，為臨床提供了一種新的微量、便捷、高效的CMV-IgM 抗體的檢測方法。