替加環素聯合5 種抗菌藥物對耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌體外抗菌作用的研究

郎磊，李娜，陳露，蘆曉慶，朱立勤，2，張堅磊

（1.天津醫科大學一中心臨床學院藥劑科，天津300192；2.天津市第一中心醫院藥劑科，天津300192；3.天津市第一中心醫院檢驗科，天津300192）

近年，臨床上普遍使用廣譜抗菌藥物，并不科學的用藥方案等，這些因素都會讓細菌表現出耐藥性。替加環素主要用于解決抗菌藥物耐藥相關的問題[1]。替加環素本質上屬于一種抑菌劑，體外及體內試驗均證明具有廣泛的抗菌譜[2]。一些學者研究指出，在治療過程中若僅采用了替加環素，在這種背景下肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌就會受到影響，進而對替加環素有著相對更低的敏感性，而聯合用藥可以有效的解決該問題[3]。不過現階段，替加環素聯合其他抗菌藥物對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌體外活性的研究較多，而抗菌藥物聯合藥敏試驗對耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細菌（carbapenemresistant enterobacteriaceae,CRE）的聯合藥敏試驗較少[4-5]。在張艷君等[6]及馮旭慧等[7]的研究中，在臨床收集的CRE 的菌株中，根據統計結果可知，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢出率居首位。

CRKP 廣泛存在于自然界的土壤和水中，容易定植于住院患者的腸道和呼吸道。CRKP 作為一種院內感染常見的條件致病菌，在患者免疫力低下時，可以導致血液、消化道、泌尿道、下呼吸道皮膚軟組織以及手術切口等多個部位的感染[8]。CRKP 被定義為對任何碳青霉烯類藥物敏感性降低的CRKP 分離株（MIC≥ 2 mg/L），CRKP 對多種抗生素耐藥，臨床上用于治療CRKP 的抗菌藥包括多粘菌素、氨基糖苷類、替加環素。隨著抗菌藥物的廣泛使用，CRKP對替加環素等藥物的敏感性在逐漸降低[9-10]。選擇有效的抗菌藥物治療CRKP 的感染已經稱為迫切的問題。因此，在本研究中使用E-test 法評價替加環素分別聯合妥布霉素等，后續就需要對抑菌濃度指數進行選擇，保證聯合用藥是最為科學的，基于此實現對CRKP 感染有效控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 在此次實驗中主要選用了KPC-2 型碳青霉烯酶的CRKP，該類型菌具體由天津市第一中心醫院檢驗科實現分離，藥敏測定的標準質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。使用法國生物梅里埃公司Vitek MS 質譜儀對細菌進行鑒定并與標準數據庫進行對比，判定標準為待測菌株與標準菌株圖譜一致性的百分比可信值。

1.1.2 培養基和藥敏試紙條 此實驗中需要用到MH 瓊脂培養基（一次性），哥倫比亞血瓊脂培養基，（上海科瑪嘉微生物技術有限公司），替加環素藥敏試紙條，妥布霉素藥敏試紙條，哌拉西林/他唑巴坦藥敏試紙條，磷霉素藥敏試紙條，復方新諾明藥敏試紙條，左氧氟沙星藥敏試紙條（以上均來自溫州市康泰生物科技有限公司）。

1.1.3 儀器設備 細菌多點接種儀，Vitek MS 質譜儀，細菌標準比濁儀，微量移液槍以及Panasonic 細菌培養箱。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 在哥倫比亞血瓊脂培養基中接種，后續就需要將其轉移到培養箱中，相應的溫度條件為35℃，同時相應空氣條件為5%CO2，基于此實現過夜培養。

1.2.2 細菌鑒定 基于Vitek MS 質譜儀對單個細菌菌落來實現菌種鑒定，這一過程中主要應用了直接涂布法。在采集完成了圖譜數據后，后續就需要將其對比標準數據庫，在判定待測菌株圖譜與標準菌株圖譜所表現出一致性的過程中，此次實驗主要基于百分比可信值來實現。若該值所存在的范圍為60.0%～99.9%，意味著有著非常可靠的鑒定結果，若出現了小于60.0%的情況，意味有著極不可靠的鑒定結果。

1.2.3 E-test 法測定單藥的MIC 值 E-test 試驗按說明書操作測定MIC。基于CLSI 2016 年來判讀藥敏結果。詳述如下：（1）抑菌環尖所對應的方向處于齒輪間，這種情況下所選擇的值要盡量大一些。（2）試條側環尖有著不同的高度，這種情況下所選擇的值要盡量大一些。（3）菌落存在于抑菌環中，此時MIC 值的確定主要考慮MRS。基于折點標準來測定替加環素、磷霉素所表現出的敏感性，該項標準主要源自于歐洲藥敏試驗委員會。

1.2.4 聯合藥敏試驗 試驗組合如下，A 組：替加環素+妥布霉素；B 組：替加環素+哌拉西林/他唑巴坦；C 組：替加環素+磷霉素；D 組：替加環素+復方新諾明；E 組：替加環素+左氧氟沙星。首先，制備耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細菌的菌懸液以及瓊脂平板，后續在瓊脂上置E-test 藥敏測試條，具體形式為較差形式，MIC 的交叉點間所需要達到的角度為90°角。分成兩份，轉移到平板中，選擇在37℃的溫度條件下進行孵育，該環節所消耗的時間即24 h，后續對水滴狀抑菌環進行仔細的觀察，環尖與某一濃度值相對應，在此基礎之上也就獲得了最低抑菌濃度，對 MICA藥聯合和 MICB藥聯合。進行分別記錄，FICI 的計算主要采用了 MICA藥聯合和 MICB藥聯合，詳細如下 FICI =MICA藥聯用/MICA藥單用+MICB藥聯用/MICB藥單用。在判讀FICI 的過程中所需要遵循的標準：在FICI≤0.5 的情況下，此時就可以判斷為存在著協同作用；在FICI 在0.5～1.0 的情況下，此時就可以判斷為存在著部分協同作用；若存在著FICI 在1.0～4.0 的情況，此時就可以判斷為不存在相關作用；若存在著FICI＞4.0 的情況下，此時就可以判斷為存在著拮抗作用[11-12]。

2 結果

2.1 單藥藥敏試驗結果 分析圖1 和表1 能夠了解到，對CRKP，替加環素和復方新諾明表現出一定程度的敏感性，MIC 在此次實驗中具體為0.25 μg/mL，磷霉素等單藥對CRKP 的實驗結果則呈現為耐藥性。

圖1 單藥藥敏試驗Fig 1 The results of single drug sensitivity test

表1 耐碳氫霉烯的CRKP 對不同抗菌藥物的敏感性試驗結果Tab 1 The results of sensitivity test of CRKP against different antibacterial agents

2.2 聯合藥敏試驗結果 替加環素分別與5 種不同的抗菌藥物聯用后，抗菌藥物單用與聯用后的MIC 值見表2、圖2。從表2 中可以看到，替加環素在與復方新諾明聯用后，替加環素MIC 值表現出下降趨勢，而與妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、磷霉素、左氧氟沙星聯用后沒有觀察到替加環素MIC 值的下降，見圖2。替加環素與復方新諾明進行聯合用藥試驗中，FICI 經過試驗后確定為1，這種情況下就可以判定為部分協同作用；而妥布霉素，哌拉西林/他唑巴坦，磷霉素和左氧氟沙星的聯合方案的FICI值為2，屬無相關作用。

圖2 替加環素聯合藥物方案對CRKP 的作用Fig 2 Effects of tigecycline combined with antibacterial agents against CRKP

表2 替加環素與妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、磷霉素、復方新諾明、左氧氟沙星單用和聯用對CRKP 的MICTab2 The MIC of tigecycline with tobramycin,piperacillin/tazobactam, fosfomycin, trimethoprim/sulfamethoxazole, levofloxacin alone and in combination for CRKP

3 討論

CRKP 首次分離于1996 年，導致了醫院感染，該問題開始被關注[13-15]。據國家衛生和計劃生育委員會全國耐藥監測網報道顯示CRKP 株的臨床檢出率呈逐年增高的趨勢，對常見抗菌藥物的耐藥率也隨之增加[16]。臨床研究指出，在治療過程中若僅采用了替加環素，CRKP 和鮑曼不動桿菌就會受到影響，進而對替加環素有著相對更低的敏感性，而聯合用藥則不存在該問題[1-2]。CRAB 研究偏多，要遠多于CRE[4-5]。因此需要對臨床分離的耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細菌進行聯合藥敏試驗，以指導臨床有效控制CRKP 的感染并提供更多合理可行的抗生素聯用方案。

本研究藥敏結果顯示，替加環素和復方新諾明MIC 均為 0.25 μg/mL，妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦和磷霉素的 MIC 均＞256 μg/mL，對 CRKP 表現耐藥，左氧氟沙星 MIC 為＞32 μg/mL，對 CRKP 耐藥，與宋國蓉等[17]報道相似。張艷君等[6]在2013-2014 年分離的538 株CRE 基礎之上，采用常用抗菌藥物來探究其耐藥情況，CRKP 對替加環素僅有著4.5%的耐藥率，其他要高一些。Kanerva 等[18]則從KPC-KP敏感性角度展開研究，結果顯示敏感的僅為替加環素以及復方新諾明，顯示耐藥的則為妥布霉素。同樣地，Ozbek 等[19]在研究中展開了體外敏感性實驗，研究對象為40 株CRE，研究用藥則為替加環素，結果顯示敏感的 CRE 占 90%，MIC 為 0.125～8 μg/mL。

很多方法可監測MIC，E-test 法有直觀結果，不過成本高[20]。國產插入式藥敏試紙條有相對較低的價格，表現出非常出色的一致性，高靈寶等[21]認為，使用國產插入式試紙條所獲得的MIC 結果在很大程度上接近于進口平貼式E-test 試紙條（94.7%），高靈寶和陳亞寶[22]的一項研究結果顯示，阿米卡星、頭孢唑啉、頭孢西丁、氨芐西林、亞胺培南插入式E-test 藥敏條與5 種進口E-test 藥敏條測定50 株細菌MIC 符合率分別為100%、98%、98%、98%和96%。劉亞麗等[23]研究結果顯示5 種國產E-test 藥敏條（青霉素、氯霉素、萬古霉素、兩性霉素B、氟康唑）與進口E-test 藥敏條的基本一致（essential agreement,EA）率均＞90%。本實驗采用了國產插入式藥敏試紙條。

替加環素與細菌核糖體的30S 亞基有效的結合，轉移RNA 進入核糖體的A 位點可被阻斷，對細菌蛋白質合成具有一定的抑制作用[24]。復方新諾明可以抑菌,兩者表現出協同作用。

深入研究目前的抗菌藥物，探索不同合用方案，有利于對CRE 感染更好的治療。不過當前只能展開體外實驗，對于體外藥敏試驗來講，其在很大程度上不同于體內藥物療效[25]。不過體外聯合藥敏實驗依然有著較高的價值，可以拓展治療思路，同時可以讓合用藥治療方案變得更加合理。

最終結果顯示，替加環素和復方新諾明對CRKP是敏感的，在此次實驗中采用磷霉素等單藥來治療CRE 的結果顯示并不存在任何的關聯性，而替加環素聯合復方新諾明在體外對CRKP 具有一定抗菌效應，在體內所能達到的治療效果是好與壞還無法明確，這一方面是有待深入研究驗證的。