重度子癇前期人胎盤絨毛膜板動脈中鈣激活氯離子通道的表達情況

蘭秋麗，傅曉冬

西南醫科大學附屬醫院 產科(瀘州 646000)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy,HDCP)是一類妊娠與血壓升高并存且嚴重影響母兒健康的疾病,可造成多器官和系統損害，導致不良妊娠結局。鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一類分布于細胞膜，由細胞內鈣離子激活而轉運陰離子的離子通道，2008年研究[1]揭示，跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)乃該通道分子基礎,有研究[2-3]發現，多部位的動脈平滑肌、血管內皮細胞中均有表達，在調節血管收縮和血管張力中具有重要作用。本研究通過比較TMEM16A在正常妊娠與重度子癇前期不同類型患者的胎盤絨毛膜板動脈中的表達差異情況，探究該通道與妊娠期高血壓疾病之間的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年11月至2019年6月于西南醫科大學附屬醫院產科分娩的50例孕婦作為研究對象。其中正常孕婦20例作為對照組(normal control，NC)，重度子癇前期20例作為重度孕癇前期組(severe preeclampsia,SPE)；早發型重度子癇前期(early-onsetsevere preeclampsia,ESPE)及晚發型重度子癇前期(late-onset severe preeclampsia,LSPE)各15例成組進行比較；重度子癇前期診斷標準參考人民衛生出版社第九版婦產科學[6]，其中發病孕周<34周診斷為早發型重度子癇前期，>34周診斷為晚發型重度子癇前期，均不伴胎兒生長受限。納入標準：22～45歲育齡期婦女；單胎妊娠；根據早孕超聲核實孕周，孕周準確。排除標準：妊娠期糖尿病、妊娠期肝內膽汁淤積、妊娠合并心臟病等妊娠相關疾病。本研究獲西南醫科大學附屬醫院倫理審批，標本取材前與患者及家屬溝通并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 按上述標準選取的研究對象，無論經陰道分娩或剖宮產分娩，無論自然臨產抑或病情需要終止妊娠，在胎盤娩出后盡快辨認胎盤膜板動脈分支，銳性取下標本放入標本箱中立即運回實驗室，在冰上鈍銳性分離膜板動脈表面系膜及其他組織，在無菌水中漂洗干凈后放入無菌EP管中，做好標記放入-80 ℃冰箱。

1.2.2 主要試劑、儀器及耗材 總RNA提取試劑盒，QuantiNova SYBR Green PCR Kit，2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN, China)，Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix，TMEM16A及β-actin基因上下游引物由上海Sangon Biotech合成，RIPA 裂解液，BCA蛋白定量試劑盒,蛋白酶抑制劑PMSF，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)；β-actinmonoclonal antibody,Recombinnant Anti-TMEM16A antibody(SP31)，Goat anti-Rabbit Secondary Antibody。核酸濃度檢測儀，凝膠成像系統，實時熒光定量PCR系統，蛋白電泳-轉膜系統，一體式化學發光成像儀。

1.2.3 實時熒光定量PCR主要步驟 在液氮的低溫維持下將標本研磨成粉末狀，取80 mg與裂解液1 mL分裝在無菌EP管中充分裂解，然后按分離、沉淀、洗滌、溶解的步驟提取RNA,并加入配置好的瓊脂糖凝膠后電泳，再用凝膠成像系統成像觀察其完整度；完整度較好的通過RNA光譜分析系統測定濃度，據濃度將RNA逆轉錄成cDNA,選取β-actin作為內參基因，通過QPCR系統測定目的基因TMEM16A mRNA相對表達量。

1.2.4 蛋白質印跡技術主要步驟 在液氮的低溫維持下將標本研磨成粉末，取100 mg與RIPA蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑PMSF)1 mL分裝在無菌EP管中充分裂解，再用超聲破碎儀裂解細胞，取上清液加蛋白上樣緩沖液，加熱使蛋白變性后置于-20 ℃低溫中保存，經過配膠、加樣、電泳、轉膜(內參的分子量為43 kDa,TMEM16A的分子量為114 kDa)、封閉、過夜孵育一抗(內參一抗稀釋比例為1∶2 000，TMEM16A一抗稀釋比例為1∶2 000)，PBST洗膜后孵育二抗2 h(內參一抗稀釋比例為1∶5 000， TMEM16A一抗稀釋比例為1∶5 000)，洗膜后置加發光液，于成像儀中成像后測定灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般資料比較

NC組與SPE組血壓比較，差異有統計學意義(P<0.05)；分娩孕周、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)；ESPE組與LSPE組分娩孕周比較，差異有統計學意義(P<0.05)；年齡、血壓比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表1～2)。

表1 NC組、SPE組的基本資料比較

表2 ESPE組、LSPE組的基本資料的比較

2.2 NC、SPE組及ESPE、LSPE組中TMEM16A mRNA的相對定量水平比較

NC組△CT值水平為(15.15±0.81)，SPE組△CT值水平為(13.86±0.54)，2-ΔΔCt值水平為(2.50±0.50)，SPE組胎盤模板動脈上TMEM16A mRNA的表達水平是正常組的(2.50±0.50)倍，二者差異有統計學有意義(P<0.05)，即ESPE組△CT值水平為(14.11±0.70)，2-ΔΔCt值水平為(2.22±0.41)，LSPE組△CT值水平為(12.99±0.46)，LSPE組TMEM16A mRNA的表達水平是ESPE組的(2.22±0.41)倍，二者差異有統計學意義(P<0.05)(表3～4)。

類別ΔCt值2-ΔΔCt 值NC組15.15±0.81-SPE組13.86±0.542.50±0.50t5.939P<0.001

類別ΔCt值2-ΔΔCt 值ESPE組14.11±0.70-LSPE組12.99±0.462.22±0.41t5.218P<0.001

2.3 NC、SPE組及ESPE、LSPE組中TMEM16A蛋白的表達情況

NC組和SPE組灰度值比值經Levene′s方差齊性檢驗提示方差不齊，采用兩獨立樣本的t′檢驗進行分析，在NC組中TMEM16A的蛋白灰度值比值為(0.28±0.07)，在SPE組中的蛋白灰度值比值為(0.62±0.25)，二者差異有統計學意義(t′=-4.186，P=0.002)；ESPE組和LSPE組灰度值比值經Levene′s方差齊性檢驗提示方差齊，采用兩獨立樣本的t檢驗進行分析，在ESPE組中蛋白灰度值比值為(0.47±0.18)，在LSPE組中蛋白灰度值比值(0.75±0.29)，二者差異有統計學意義(t=-2.524，P=0.021)(圖1)。

3 討論

HDCP是一種多因素、多通路及多機制誘發的疾病，在全身小血管痙攣和血管內皮損傷的基礎上出現全身多器官和系統損害[4-6]，病情多復雜、變化快，多可導致不良妊娠結局，目前針對發病機制的研究中“兩階段”學說被大部分學者認同[5]，包括子宮螺旋動脈滋養細胞重鑄不足，胎盤淺著床導致缺血、缺氧，釋放胎盤因子；胎盤因子進入母體血液循環，促使炎癥免疫過度激活及血管內皮損傷兩個階段，誘發血管痙攣、血壓升高等高血壓的一系列變化。胎盤血管不受神經支配[7]，其血管緊張度的調節受血液供應所帶離子或分子的控制[8]，在血管的平滑肌細胞和內皮細胞上作用的離子通道是細胞內外離子交換保持穩態的重要通道，若表達和功能發生異常會導致細胞內外離子失衡，同時引起血管張力紊亂，成為各種血管性疾病的病理性生理基礎，盡管妊娠期高血壓疾病與高血壓發病機制不盡相同，但HDCP仍屬血管性疾病，故在對HDCP發病機制的研究中，對通道的研究較廣泛，其中主要包括鉀通道、氯離子通道、水通道及瞬時受體電位通道[9]，目前鉀通道研究最多、最全面的通道，而氯離子通道與HDCP的相關研究極少，有研究[10]提示，在心血管系統中主動脈至毛細血管均有TMEM16A表達，其在血壓和外周阻力的調控中發揮重要作用。近年TMEM16A在女性生殖系統中的分布和作用的逐漸被揭示[11-13]，如參與子宮平滑肌的收縮、婦科腫瘤的發生、卵巢激素的產生、受精著床等過程，通過對該通道的研究拓展對相關疾病認知及治療具有一定價值，如通過TMEM16A在正常妊娠及HDCP不同類型中的表達情況探究兩者的相關性，為HDCP發病機制的完善奠定理論基礎。

氯離子是人體內主要陰離子，而介導氯離子轉運的氯離子通道廣泛存在于人體內，血管平滑肌上主要有鈣激活氯離子通道、容量敏感性氯離子通道和鈣依賴性氯離子通道3類氯離子通道，近年鈣激活氯離子通道在調控血管收縮方面作用逐漸被揭示，成為藥物精準靶向治療肺動脈高壓、高血壓、腫瘤等相關疾病的研究熱點，CaCCs受電壓和鈣離子濃度雙重調節[14]，表現為若細胞內游離Ca2+濃度升高則可誘發通道開放，研究[15]證實，HDCP患者血漿鈣離子濃度減低，細胞內鈣離子濃度明顯升高，由此可推測，在HDCP患者的血管平滑肌上該特點可誘發鈣激活氯離子通道充分開放產生瞬時的內向電流，導致平滑細胞節律性收縮增強，參與外周阻力及血壓的調節。研究[16]表明，TMEM16A 通道會產生Cl--Ca2+電流，且激活會導致血管和非血管平滑肌中的膜去極化和收縮。自TMEM16A被確認為CaCCs的基礎分子以來，有研究[17]證實，TMEM16A在高血壓模型中顯著上調，2015年唐巧云[18]提出，TMEM16A具有雙重作用 ，既是高血壓發生的致病機制，又具有保護因子的作用，如在原發性高血壓中TMEM16A與血壓呈正相關，而在腎性高血壓中則相反[19]。研究[18]表明，TMEM16A的上調可促進基底細胞增殖，過度表達則抑制細胞增殖，起保護作用，在TMEM16A的缺如情況下，血管對促收縮介質不敏感。但仍有研究[20]結果與此相反，認為高血壓的腸系膜動脈中TMEM16A的表達下調，并表示與中山大學在第九屆全國心血管藥理學術會議中的一項研究[21]相同，即TMEM16A可能是通過下調表達來限制血壓繼續升高來發揮保護作用，也可能是長期高血壓狀態下發生了結構變化。趙美平等[22]研究中還提出，低氧或缺氧狀態會導致TMEM16A高表達而促進血管平滑肌的增殖和重建，而血管平滑肌的增殖會造成血管收縮增加，與HDCP胎盤缺血缺氧的理論相似，由此推測TMEM16A可能參與HDCP的發生發展。

20世紀80年代由于早發型子癇前期對母嬰健康的嚴重影響，引起歐美圍產醫學界高度重視，診斷以HDCP的發病孕周為主，但臨床表現及危害程度與晚發型的差異大，因此有學者推測早發型及晚發型子癇前期可能是HDCP的兩種亞型。早發型性子癇前期臨床表現為“胎盤源性”疾病特點，即母體及胎兒雙方致病，甚至可導致妊娠終止后母嬰的遠期不良預后，而晚發型則表現為“母源性”疾病特點，以對母體的影響為主，對胎兒危害相對較小。本研究結果表明，HDCP患者的胎盤膜板動脈中TMEM16A的表達明顯高于正常組，但在重度子癇前期中晚發型明顯高于早發型，與預想趨勢相悖，結合唐巧云[18]、郭書紅[20]及張政等[21]的研究中提出的TMEM16A在血壓調控中可能具有雙重作用，可通過下調來限制血管過分收縮，起保護因子的作用，由此推測，TMEM16A可能因受到負反饋調節以同樣機制在早發型子癇前期患者中起保護作用，抑或高濃度鈣離子的過度刺激導致TMEM16A發生了結構或功能的變化等。目前TMEM16A參與血管性疾病發病機制研究尚不全面，范圍局限在動物模型或局部探索的基礎上，仍有許多問題待解決，如若該通道具有雙重作用，那么過度表達的范圍如何界定，激發TMEM16A成為保護因子的條件等均需進一步研究。

綜上所述，TMEM16A在重度子癇前期組中的表達明顯上調，但重度子癇前期晚發型表達高于早發型，表明此通道與HDCP具有相關性，但其參與HDCP發生的機制尚不清楚，需進一步探究，如通過干預HDCP高風險患者TMEM16A的表達可否改變疾病的發展方向，臍帶血管的表達情況與妊娠結局的關系；可通過血管環、妊娠高血壓模型等進一步研究兩者的因果關系，明確鈣激活氯離子通道參與HDCP的機制，為完善HDCP發病機制學說及藥物靶向治療提供新的途徑。