艾灸對結腸炎相關性結腸癌大鼠 P2X7受體、Wnt/β-catenin信號通路影響的研究

陸嫄，顧沐恩，丁邦友，丁光宏，鄭寒丹，李璟，馬曉芃，吳璐一，李琪，黃艷，劉慧榮，吳煥淦

(1.上海市針灸經絡研究所，上海 200030;2.復旦大學，上海 200433;3.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437;4.上海中醫藥大學針灸免疫效應重點研究室，上海 201203)

結腸炎相關性結腸癌(colitis-associated cancer，CAC)是結直腸癌的一種亞型，與潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)等炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)相關[1]，其中UC發生癌變的幾率遠高于其他人群，且隨病程延長發病率升高，病程 30年以上的UC患者CAC患病率高達33.2%[2]。

CAC是典型的炎癥介導的癌癥，結腸慢性炎癥是癌變的催化劑[3]。法國研究者觀察 P2X7R基因敲除對CAC小鼠的影響，研究發現，P2X7R基因敲除會導致TGFβ1的高表達、Treg細胞的募集以及TGFβ1介導的結腸上皮細胞增殖，表明P2X7R在CAC早期進展中發揮了腫瘤抑制作用[4]。P2X7R還能通過抑制GSK3β進而抑制Wnt/β-catenin通路的信號轉導[5]。在CAC炎癥介導的癌癥中，Wnt/β-catenin信號通路可誘導上皮間質轉化，與結腸組織腫瘤發生、發展密切相關，β-catenin是Wnt途徑中最為關鍵的轉導子，參與結腸炎相關癌變[6]。抑制異常激活的Wnt/GSK3β/β-catenin信號通路轉導，能延緩CAC進展[7-9]。

目前 CAC的發病機制尚未完全闡明，對阻遏結腸慢性炎癥進展為CAC，也尚無明確的治療手段。筆者團隊從事灸法治療IBD 30余年，明確了艾灸能有效減輕IBD結腸炎癥反應，隔藥灸可下調UC中與癌變密切相關的p53和C-myc基因表達[10]。為了進一步研究艾灸對CAC的治療作用，本研究從P2X7R和Wnt/β-catenin信號通路的角度，探討隔藥灸和隔姜灸對 CAC大鼠的干預效應及效應機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為近交系雄性清潔級 SD大鼠，體質量(100±20)g，共 26只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[動物許可證號SCXK(滬)2012-0002]。將26只大鼠分籠飼養，適應性飼養 1周，溫度控制在 18℃～22℃，濕度控制在 50%～70%，同時保持 12 h晝夜節律。實驗中所有操作均遵循美國國立衛生研究院及上海市實驗動物倫理委員會的規定。

1.2 試劑與儀器

葡聚糖硫酸(DSS，分子量 36000～50000，MP biomedicals公司，美國);氧化偶氮甲烷(AOM，Sigma公司，美國);戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司，中國);RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠配制試劑盒、ECL發光試劑盒、一抗二抗稀釋液(上海威奧生物科技有限公司，中國);RNA酶抑制劑、Trizol(Invitrogen公司，美國);兔抗大鼠一抗P2X7R(Sigma公司，美國);GAPDH抗體(CST公司，美國)。

組織脫水機、組織包埋機、石蠟切片機、展片機(Leica公司，德國);小型Trans Blot轉印槽(Bio-Rad公司，美國);NanoDrop超微量分光光度計(Thermo Scientific公司，美國);凝膠成像系統 GIS-1600(上海天能科技有限公司，中國);ABI ViiA 7 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司，美國);光學顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.3 造模方法

大鼠適應性喂養1周，將26只SD大鼠隨機分為正常組6只和造模組20只，參考Greten FR等[11]方法構建CAC模型。每只造模大鼠腹腔注射AOM(10 mg/kg)，1周后予以反復3個周期的炎癥刺激(3%-2%-2%)。其中第1個周期，3%DSS自由飲水4 d后改用正常飲水17 d;第2周期，2%DSS自由飲水4 d后改用正常飲水17 d;第3個周期采用2%DSS自由飲水4 d后改用正常飲水至結束(見圖1)。每日稱量體質量，觀察并記錄大鼠大體情況，造模結束隨機抽取2只麻醉后，沿著結腸系膜剖開肉眼下觀察腫瘤是否生成，以評價模型建立是否成功。

圖1 結腸炎相關性結腸癌大鼠模型構建流程圖

1.4 分組方法

為了觀察隔藥灸和隔姜灸對大鼠CAC的干預作用，將18只CAC大鼠采用分層隨機法分為CAC組、隔藥灸組和隔姜灸組，每組6只。CAC組和正常組均不進行任何干預，做與隔藥灸組和隔姜灸組相同的固定;隔藥灸組和隔姜灸組于造模結束后次日開始相應干預，共干預30 d。

1.5 治療方法

取天樞(雙)、氣海穴，穴位定位參考《實驗針灸學》[12]。于造模結束當日用實驗動物專用除毛器將各治療組大鼠腹部天樞及氣海穴附近鼠毛剃除，第 2天起予以灸法干預。每日固定時間操作，室溫控制在(25±1)℃，相對濕度為(55±10)%RH，風速≤1 m/s，操作前大鼠適應環境20 min，盡可能避免不必要的干擾。

1.5.1 隔藥灸治療

將附子(四川)、肉桂(廣西)、木香(云南)等藥研末與黃酒調和，采用特制模具按壓成直徑 0.8 cm、厚0.4 cm的藥餅，在藥餅上放置艾炷(重量約90 mg)對相應穴位進行隔藥灸治療。每日1次，每次每穴灸2壯，每周6次，共灸30次。

1.5.2 隔姜灸治療

選用新鮮生姜，沿生姜纖維縱向切取直徑0.8 cm、厚0.4 cm的姜片，在姜片上放置艾炷(重量約90 mg)對相應穴位進行隔姜灸治療。每日1次，每次每穴灸2壯，每周6次，共灸30次。

1.6 動物標本取材

2%戊巴比妥鈉(40～50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉成功后，將大鼠固定于解剖板上，自恥骨聯合處-盲腸取下約5 cm的結腸，沿腸系膜縱行剖開結腸，結腸予生理鹽水沖洗后，觀察結腸大體情況，肉眼觀察并記錄瘤體數量，剪下一段長約1 cm含瘤體的結腸，固定于 4%多聚甲醛中，剩下的結腸剪碎混合后平均分成 2份，置液氮1 h后，于﹣80℃冰箱保存備用。

1.7 觀察指標

1.7.1 大鼠一般情況觀察、DAI和成瘤率觀察

每日觀察各組大鼠一般情況，包括體質量、毛色、活動度、大便性狀等。比較各組大鼠體質量、疾病活動指數(disease activity index，DAI)[13]和結腸成瘤率。DAI=(體質量下降分數＋糞便性狀分數＋隱血分數)/3。

1.7.2 大鼠結腸組織病理學觀察

將含瘤體的結腸組織脫水、包埋，4 μm厚度連續切片，展片烤片。取瘤體部位切片觀察。采用蘇木精伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法染色。具體步驟如下，切片脫蠟至水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，100%、90%、80%、70%梯度乙醇各5 min，雙蒸水漂洗5 min×2次，蘇木精染色液2 min，流水沖洗10 min，1%鹽酸乙醇分化約 5 s，流水沖洗 5 min，伊紅染色液 2 min，70%、80%、90%、100%梯度乙醇脫水各 8 s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各15 min，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。

1.7.3 采用Western Blot法檢測P2X7R蛋白表達

取大鼠結腸組織剪碎后研磨，經RIPA裂解、離心取上清等流程后，取部分上清蛋白用 BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。后進行電泳、轉膜后加入5%BSA室溫封閉2 h，并加入封閉液稀釋的兔抗大鼠一抗P2X7R(1:1000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3次，后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔二抗(1:2000)室溫孵育2 h，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。采用P27XR與內參GAPDH兩者灰度值的比值作為統計依據。

1.7.4 采用RT-qPCR法檢測C-myc、GSK3β、Wnt1和β-catenin的mRNA表達

大鼠結腸組織經研磨后采用 Trizol裂解方法提取總 RNA，按順序加入試劑與反應物進行逆轉錄反應后，進行聚合酶鏈反應。擴增引物序列見表1。反應條件為95℃ 2 min，1個循環;94℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃40 s，40個循環。采用2﹣△△Ct法對所得數據進行分析，得到所有基因的Ct值后，根據公式△Ct值=目的基因Ct值－內參基因Ct值，計算出每一個基因的△Ct值，然后用各組樣本的△Ct值減去模型組樣本的△Ct值，對所有數值取相反數，得到﹣△△Ct值，最后對﹣△△Ct值進行2的冪運算，即2-△△Ct值。

表1 引物堿基序列

1.8 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件進行統計分析，對數據進行正態性和方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊的計量資料用均數±標準差表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，若有統計學差異，則進一步采用LSD法進行組間兩兩比較;不符合正態分布或方差不齊的數據，用非參數檢驗，若有統計學差異，則進一步采用Dunnett’s T3法進行組間兩兩比較。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察

干預結束后，正常組大鼠活動正常，反應敏捷，皮毛柔順有光澤，大便正常;CAC組大鼠精神萎靡，皮毛蓬亂，松散易脫落，肛門處有鮮血，大便表面覆有鮮血;隔藥灸組、隔姜灸組大鼠皮毛欠光澤，活動略遲緩，便血量較CAC組有所減少，精神狀態有所改善。

2.2 各組大鼠體質量、DAl、結腸成瘤率比較

從圖2A、2B可見，與正常組相比，CAC組大鼠體質量顯著降低，DAI顯著增高(P＜0.05);與CAC組相比，隔藥灸組和隔姜灸組大鼠體質量均顯著增加，DAI顯著降低(P＜0.05)。圖 2C為大鼠結腸大體形態顯示，可見CAC組、隔藥灸組和隔姜灸組大鼠結腸瘤體形成。CAC組大鼠成瘤率83.3%，隔姜灸組為20.0%，隔藥灸組為 33.3%，CAC組大鼠成瘤率與隔姜灸組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示隔藥灸和隔姜灸均能顯著改善CAC大鼠體質量降低、便血等一般情況，且隔姜灸對瘤體生長有一定的抑制作用。

2.3 大鼠結腸瘤體組織形態學觀察

由圖3可見，正常組大鼠結腸黏膜結構清晰，結腸上皮組織完整，腺體排列整齊，黏膜固有層可見毛細血管和少量散在的淋巴細胞，無明顯的炎性細胞浸潤，未見充血、水腫等;CAC組大鼠結腸上皮細胞排列較亂、大小不一、形態多樣、極性消失，細胞核大而濃染，核質比例增大，核分裂增多，可見腺管共壁背靠背和篩樣結構，高級別腺癌形成，腺腔內多見脫落壞死的瘤細胞、浸潤的炎性細胞及呈團狀的嗜酸性物質(紅色箭頭標示);隔藥灸組大鼠結腸上皮細胞增生，排列不齊，炎性細胞浸潤和黏膜充血水腫程度較 CAC組減輕，可見異性增生。隔姜灸組大鼠結腸上皮細胞增生，核濃染，淋巴細胞浸潤，固有腺體萎縮，異型增生與CAC組相比程度較低。

圖2 大鼠體質量、DAl和結腸成瘤率比較

圖3 大鼠結腸組織HE染色(×200)

2.4 大鼠結腸組織P2X7R蛋白表達

由圖4可見，與正常組相比，P2X7R在CAC組大鼠結腸組織中的表達下調，差異有統計學意義(P＜0.05);與CAC組相比，P2X7R在隔藥灸組和隔姜灸組大鼠結腸中的表達均上調，差異均有統計學意義(P=0.006，P=0.003)，提示隔藥灸和隔姜灸能顯著上調 CAC大鼠結腸異常表達的P2X7R蛋白。

2.5 大鼠結腸組織mRNA表達

由圖5可見，與正常組相比，C-myc、β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA在CAC組大鼠結腸組織中的表達上調，差異均有統計學意義(P＜0.05);與CAC組相比，C-myc mRNA在隔藥灸組和隔姜灸組大鼠結腸組織中的表達下調，差異有統計學意義(P＜0.05)，β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA在隔姜灸組大鼠結腸組織中表達顯著下調，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖4 大鼠結腸組織P2X7R蛋白表達

結果提示隔藥灸和隔姜灸對 CAC大鼠Wnt/β-catenin通路發揮了負性調控作用，隔姜灸對異常高表達的β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA下調趨勢優于隔藥灸。

圖5 大鼠結腸組織C-myc、β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA表達

3 討論

嘌呤受體P2X7R廣泛參與炎癥反應，在DSS誘導的結腸炎小鼠結腸組織表達增加，在結腸炎相關癌變的腫瘤中也有表達[4]。P2X7R是腫瘤傳送ATP信號的中央控制節點，以其為核心的 P2X7/PIDK/AKT軸和 P2X7/AMPK/PRAS40/mTOR信號軸調控腫瘤的生長與自噬，調節腫瘤細胞存活與死亡之間的平衡[14]。研究表明，P2X7R在小鼠CAC進展過程中具有一定的抑制作用。使用P2X7R拮抗劑可減緩CAC小鼠的體質量增長，促進腸道腫瘤的形成，降低小鼠生存率;而P2X7R激動劑則表現出對CAC小鼠腸道腫瘤形成的抑制作用[15]。本研究結果顯示，P2X7R在CAC組大鼠結腸組織中的表達顯著低于正常組，經隔藥灸和隔姜灸干預后，CAC大鼠結腸組織中 P2X7R的表達上調，提示隔藥灸和隔姜灸可能通過激活CAC大鼠結腸中P2X7R的表達，起到抑制結腸腫瘤生長的作用。

CAC是涉及多基因、多信號通路的復雜過程。Wnt/β-catenin信號通路在結腸上皮再生和腫瘤發展中至關重要。Wnt通路調控β-catenin磷酸化、β-catenin核內異常轉錄介導 CAC發生[6]。有研究表明，P2X7R還能通過抑制 GSK3β進而抑制 Wnt/β-catenin通路的信號轉導[5]。在結腸炎癥介導的癌癥 CAC中，C-myc、Wnt、β-catenin均屬促癌基因，抑制異常激活的Wnt/GSK3β/β-catenin通路的信號轉導，可延緩 CAC腫瘤進展[7-9]。生理條件下，β-catenin的活性受到嚴格的控制，在病理狀態下可因腫瘤抑制基因APC的滅活導致對β-catenin的控制解除，繼而活化NF-κB信號，對結直腸癌的形成具有重要作用[16]。本研究結果表明，隔姜灸在 CAC大鼠的 Wnt/β-catenin通路中發揮了重要的調控作用，主要表現在抑制 Wnt家族中Wnt1和β-catenin的異常高表達，這可能是隔姜灸干預CAC的效應機制之一。β-catenin的氨基末端含有數個 GSK-3β磷酸位點，羥基末端有活化相應靶基因轉錄的功能，中間區域含有 APC蛋白、T細胞因子(TCF)結合位點，當 APC-Axin-GSK3β降解復合體形成受阻，導致β-catenin無法磷酸化使其泛素化降解，在胞漿內聚積，并進入細胞核內與 TCF/LEF轉錄因子結合，作用于下游C-myc等基因的啟動子上，導致相關基因的表達異常，促進結直腸腫瘤的發生[17]。值得注意的是，GSK-3β是一種功能復雜的多功能激酶，在腫瘤的進程中有雙向調節的作用[18]。作為促瘤因子或是抑瘤因子取決于腫瘤的類型、發展階段、遺傳背景[19]。本研究結果中，GSK-3β mRNA在CAC組大鼠結腸組織表達顯著高于正常組，經隔姜灸干預后表達顯著降低，提示隔姜灸可能通過抑制GSK-3β的表達，起到延緩CAC大鼠結腸腫瘤生長進程的作用。

本次研究設置了兩種干預方法，即隔藥灸和隔姜灸。兩種灸法均是臨床治療IBD等腸腑病癥的常用灸法[20-22]。本研究結果顯示，兩種灸法在效應和機制部分均有共通之處，也有所差異。相同點為隔藥灸和隔姜灸對CAC大鼠體質量、DAI均有顯著的改善作用，均能上調CAC大鼠結腸組織P2X7R蛋白表達，下調C-myc mRNA水平;不同點為隔姜灸干預后大鼠結腸成瘤率顯著降低，隔姜灸組大鼠結腸組織β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA表達水平均顯著下調。提示隔姜灸可能是通過對 CAC大鼠的 P2X7R、Wnt/β catenin通路異常激活進行調節發揮作用。隔藥灸和隔姜灸均為艾灸療法，均有溫熱物理刺激，天樞和氣海穴均能調節胃腸功能，艾灸天樞和氣海可明顯減輕潰瘍性結腸炎的腸道炎癥反應，故在結腸炎相關性結腸癌中也選擇了天樞、氣海。所以兩種灸法均可一定程度上抑制腫瘤的生長，均能抑制促癌基因C-myc的表達，調節嘌呤受體P2X7R的表達。兩種灸法均為隔物灸，所隔物質不同，可能導致其作用機制不盡相同。

綜上所述，隔藥灸、隔姜灸均能顯著改善CAC大鼠一般情況，對炎癥介導的結腸腫瘤生長具有一定的抑制作用。本研究采用AOM誘導，3%-2%-2% DSS多個濃度的刺激制備CAC模型，在CAC大鼠結腸組織中發現特征性癌變，在隔藥灸和隔姜灸組均見到腫瘤和異型增生等組織形態學變化，但未見癌變，說明艾灸療法能不同程度抑制炎癥介導的腫瘤生長。在前期觀察到艾灸能抑制P53和促癌基因C-myc表達的基礎上，切入炎癥和炎癥相關性癌變中均有重要生物學功能的嘌呤受體P2X7R，發現艾灸能促進CAC大鼠結腸組織P2X7R蛋白表達以及抑制C-myc的異常表達。在隔姜灸組，還發現隔姜灸可能抑制了異常激活的 Wnt/GSKβ-β/catenin信號通路。由于本實驗目前只檢測了該通路中4個關鍵蛋白的mRNA表達，后續研究將進一步開展蛋白檢測，擬闡釋艾灸在 CAC大鼠 Wnt/GSKβ-β/catenin信號通路中的作用。本研究僅采用常規的現代分子生物學技術和方法研究，尚未從P2X7R深入探討艾灸對CAC大鼠的作用機制。為了能更明確說明艾灸對炎癥介導腫瘤的作用機制，今后研究的方向一方面要切入 DSS誘導的潰瘍性結腸炎，明確P2X7R在炎癥中的作用;另一方面，在 AOM-DSS誘導的結腸炎相關性癌變中，將采用P2X7R的激動劑和抑制劑，結合P2X7R基因敲除小鼠反向驗證，從多個方面說明艾灸對炎癥和炎癥相關性腫瘤的效應機制。