藏藥五脈綠絨蒿不同部位紅外光譜判別分析

李 朵，李佩佩，欒真杰，孟曉萍，孫 菁*

1中國科學院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室，西寧 810008；2中國科學院大學，北京 100049

五脈綠絨蒿(MeconopsisquintuplinerviaRegel)為罌粟科(Papaveraceae)綠絨蒿屬(Meconopsis)多年生草本植物，藏音譯名“歐貝完保”，是使用廣泛的藏藥材，具有重要的藥用價值。《晶珠本草》記載，五脈綠絨蒿以花入藥，性味甘、澀、涼，具清熱解毒、消炎止痛的功效，可用于治療肺炎、肝炎等[1]，也可清除自由基，提高抗氧化活性[2]。相關文獻亦記載，五脈綠絨蒿可用全草或花入藥，但以花入藥解熱效果好[3]，不同的部位入藥效果不同。藥材有效成分的提取常以粉末進行[4]，粉末狀態有利于有效成分的快速有效提取，但是難以從外觀對入藥部位進行準確鑒別，而采用傳統的顯微鑒別或理化鑒別耗時耗力，不利于生產實踐應用。因此，為了保證入藥療效和擴大應用，需建立一種快速、高效、準確的原藥材部位判別方法。

中紅外光譜反映的是分子中原子的伸縮和變形振動運動，波數范圍為4 000～400 cm-1，具有快速、準確、重現性好、樣品制備少等優點，應用范圍廣泛[5-9]。目前關于中紅外光譜法鑒別藥材不同部位已有報道。Wang等[10]對白花丹參不同部位的紅外光譜、二階導數譜圖以及二維相關譜進行了研究，結果表明，白花丹參不同部位的三級鑒定均存在差異。Zhao等[11]對青海省兩個不同居群五脈綠絨蒿的花、花梗、葉和全草進行中紅外全光譜掃描，發現一維紅外光譜和二階導數譜圖能識別五脈綠絨蒿的不同部位，但是該工作僅從譜圖解析方面區分五脈綠絨蒿不同部位，判別效果不夠直觀、快速。本文在前述研究工作的基礎上，結合化學計量學方法建立五脈綠絨蒿部位判別模型，能夠更為快速直觀地識別五脈綠絨蒿不同部位。該方法不需要具備專業光譜學知識，有助于非專業人士操作，在生產實踐中具有更大的推廣應用價值，可為藥企GMP生產實踐提供更為準確快捷的檢測方法。在已有的關于中紅外光譜法鑒別藥材不同部位的報道中，大多是通過譜圖解析的方法識別藥材不同部位，或僅建立模型進行判別，利用譜圖解析結合化學計量學方法建立模型進行部位判別的研究則鮮有報道。

因此，本研究以傳統藏藥五脈綠絨蒿的葉部位、花部位及全草為研究對象，利用中紅外光譜分析技術開展了譜圖特征分析，同時結合化學計量學方法建立五脈綠絨蒿部位判別模型，從藥材源頭保證不同部位藥材的準確性，為該資源后續的質量檢測提供科學依據和有效借鑒，以期保障用藥的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

于6～7月五脈綠絨蒿植物花期，在青海省玉樹縣、循化縣和湟中縣三個地區的五脈綠絨蒿典型生長環境，即高山草甸、陰坡灌叢中采集五脈綠絨蒿全草。同一地區每隔數米采集一株全草，且隨機選取植株大小，以確保樣本能代表該地區的五脈綠絨蒿整體水平，不同地區間五脈綠絨蒿外觀上無明顯差異。將采集的植株帶回實驗室洗凈、晾干，分為花、葉及全草，共得到346份不同部位樣品，分別粉碎、過200目篩后放入干燥器，待分析用。原植物標本經中國科學院西北高原生物研究所盧學峰研究員鑒定為罌粟科綠絨蒿屬五脈綠絨蒿(MeconopsisquintuplinerviaRegel)。

1.2 儀器與試劑

儀器：IS50傅里葉變換紅外光譜分析儀(美國，Thermo Fisher公司)，烘箱(上海一恒科學儀器有限公司)，電子天平(Meterler ME104，0.000 1g)，壓片模具(直徑：13 mm，美國PIKE公司)，瑪瑙研缽，粉碎機，200目篩，干燥器。

試劑：溴化鉀(光譜純，Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 中紅外光譜的采集

利用KBr壓片法對樣品進行中紅外光譜采集，樣品顆粒度大小為200目，以樣品∶KBr=1∶100的比例進行研磨，用1.9 T的壓力進行壓片，掃描前扣除CO2和水的干擾，掃描次數為32次，分辨率為4 cm-1。采集光譜時，每個樣品采集3次，并取平均譜圖作為原始光譜。數據采集前先將儀器預熱半小時，待儀器穩定后使用。實驗室溫度保持在25 ℃左右，濕度控制在35%以下。

1.3.2 方差分析

利用SPSS軟件對各吸收峰處的吸光度值進行單因素方差分析，判斷同一吸收峰處五脈綠絨蒿不同部位的吸光度值之間是否存在差異。

1.3.3 模型的建立

研究所用的TQ Analyst軟件中應用于定性分析方法有距離匹配(Distance Match，DM)和判別分析(Discriminant Analysis，DA)方法。其中，DM是通過計算未知樣品光譜到每類物質光譜集中點的距離來判斷未知樣品與已知物質類別的匹配方法，比較結果稱為“距離匹配值”(也稱馬氏距離)，反應了樣品與標準品的匹配程度[12]。DA是一種有監督模式識別方法，通過計算未知樣品光譜到每類物質光譜中心的距離來判斷未知樣品與哪個類別最相似，結果是提供與未知樣品光譜最相似的物質類別的名稱[13]。

數學模型的建立需要具有光譜數據和其他定性數據的校正集、預測集和外部驗證集樣品，將樣品的中紅外均譜(n= 3)導入TQ Analyst軟件，利用隨機法對樣本集進行劃分，各部位選10份樣品為外部測試集，剩下的316份樣品2/3為校正集，1/3為預測集[14]，各部位樣本集分布如下(表1)。

表1 五脈綠絨蒿不同部位樣品校正集與預測集的樣本集分布Table 1 Modeling and validation distribution in different parts of M.quintuplinervia

平滑方法根據不同譜圖類型進行選擇：原譜圖不經平滑處理，一階導數譜圖(D1)、D2均經Norris平滑處理，有效位數為5，有效位間隔為5。再根據TQ Analyst軟件的建模方法、光程類型及譜圖類型的預處理方法設計正交試驗因素水平表(表2)和正交試驗表L18(2×32)，利用正交試驗及極差分析優化建模方法、光程類型及譜圖類型。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factor table of orthogonal experiment

根據正交試驗下建模條件的組合，記錄不同建模組合條件下模型的校正集誤判數和預測集誤判數，以式(1)和式(2)計算模型的識別率和預測率，以此為指標判斷模型效果，識別率和預測率最高的建模條件組合為實際最優組合。對正交試驗結果進行極差分析，得出理論最優組合。將實際最優組合與理論最優組合進行比較，選出最佳建模條件，同時利用相關系數法(Correlation Coefficient)確定建模波段。最后，利用優化的建模條件和建模波段建立部位判別模型。

識別率=(校正集總數-校正集誤判數)/

校正集總數×100%

(1)

預測率=(預測集總數-預測集誤判數)/

預測集總數×100%

(2)

1.3.4 模型評價

對所建模型進行模型性能識別評價，模型性能識別評價除采用上述識別率及預測率為指標外，另采用了誤分類率(ER)，真正率(TPR)，真負率(TNR)和F1進行評價，其中ER指分類預測錯誤的樣本比例；TPR又稱靈敏度，指正確識別陽性樣本比例；TNR指正確識別陰性樣本比例，TPR、TNR和F1越高，ER越低，分類模型的性能越好[15]。各參數計算公式如下：

ER=(FP + FN)/n

(3)

TPR=TP/(TP + FN)

(4)

TNR=TN/(FP + TN)

(5)

F1=2 × TP/(2 × TP + FP + FN)

(6)

式中，TP為真正類，表示真樣本被識別為真樣本；FN為假正類，表示真樣本被識別為偽樣本；TN為真負類，表示偽樣本被識別為偽樣本；FP為假負類，表示偽樣本被識別為真樣本，n為總樣本量。

2 結果與討論

2.1 特征譜圖分析

中紅外光譜吸收峰是基頻、倍頻或合頻吸收，具有分子結構的特征性，光譜的不同峰位、峰形代表不同的基團，峰強度代表基團的含量，它反映的是該混合體系中各個官能團的成分的疊加譜，不同混合體系的化學組成不同，故其譜圖也不同[16]。根據五脈綠絨蒿不同部位的一維平均譜圖可知(圖1)，五脈綠絨蒿不同部位的紅外譜圖大體上相似，但在2 852 cm-1處，葉部位具有明顯的吸收，而其它兩部位吸收不明顯；在1 385 cm-1處，僅全草有吸收，其他兩部位在此處沒有吸收峰。2 852 cm-1處為C-H鍵對稱伸縮振動，1 385 cm-1處為酯類C-H鍵彎曲振動，說明花和葉部位中基本不含酯類化合物，且在全譜圖范圍中，全草吸光度普遍高于其它部位，說明全草中化合物的含量高于其它部位，這與Zhao等[11]的研究結果一致。

圖1 五脈綠絨蒿不同部位中紅外一維平均譜圖Fig.1 Full MIR spectra range of different parts of M.quintuplinervia注：a：全草平均譜圖；b：葉平均譜圖；c：花平均譜圖。Note:a:Average MIR spectra of whole herbs;b:Average MIR spectra of leaves;c:Average MIR spectra of flowers.

由于不同部位的紅外譜圖大體上相似，宏觀上難以判斷不同部位是否對五脈綠絨蒿中紅外一維譜圖有影響，故在全波段范圍內，對不同部位同一吸收峰處的吸光度值進行單因素方差分析，結果見表3。

表3 不同部位同一吸收峰處的吸光度值單因素方差分析Table 3 One-way ANOVA of each absorbance of different parts

續表3(Continued Tab.3)

波數Wave munber(cm-1)變異來源Source of variation平方和Sum of squares自由度df均方Mean squareF顯著性Significance1 736部位間0.21720.10832.459**部位內1.0233060.003總變異1.2403081 634部位間0.76620.38320.600**部位內6.3783430.019總變異7.1443451 516部位間0.10020.0507.950**部位內1.3522140.006總變異1.4532161 413部位間0.57020.28530.238**部位內3.0923280.009總變異3.6623301 385部位間0.16520.0837.357**部位內1.3241180.011總變異1.4891201 322部位間0.32420.16227.762**部位內1.7122930.006總變異2.0362951 246部位間0.56220.28136.998**部位內2.5993420.008總變異3.1623441 104部位間0.70420.35218.203**部位內5.6892940.019總變異6.3932961 056部位間1.66220.83125.640**部位內11.0853420.032總變異12.748344618部位間0.38020.19047.471**部位內1.2553140.004總變異1.635316537部位間0.23920.11935.041**部位內0.6341860.003總變異0.873188

注：**P<0.01。

由表3可知，在全波段范圍內，2 852 cm-1處吸光度值之間差異不顯著，其他吸收峰處的吸光度值之間的差異均達到了極顯著水平，說明五脈綠絨蒿不同部位中化合物含量差別較大。

不同部位粉末的中紅外譜圖在全波段范圍內存在差異，但僅從宏觀上難以區分，不利于在生產實踐中的推廣應用。因此，可根據不同部位各吸收峰處吸光度值之間的差異建立五脈綠絨蒿部位判別模型，以快速準確鑒別五脈綠絨蒿的不同部位。

2.2 模型的建立

2.2.1 建模條件的優化

按正交試驗表進行正交試驗，結果如表4所示。從表4可知，No.9模型結果在所有試驗組合中最好，模型識別率為99.05%，預測率為96.19%，為實際最優組合。

表4 不同部位判別模型正交試驗結果直觀分析Table 4 Visual analysis of orthogonal test results of part discriminant model

根據各水平的K均值可知，A因素在1水平效果較好，B因素在2水平效果較好，C因素在3水平效果較好，故理論最優組合為A1B2C3，即No.6。根據R值可知，譜圖類型是影響判別模型的主要因素，其次為建模方法，光程類型對模型影響效果較小。

理論最優組合為No.6，實際最優組合為No.9，由表4可知No.9模型效果優于No.6，但兩種組合的識別率均為99.05%，No.9預測率為96.19%，No.6預測率為95.24%，相差較小，兩種組合僅光程類型不同，與極差分析中光程類型影響力度最小的結果一致。最終以No.9組合為建模條件，即建模方法為DM，光程類型為SNV，譜圖類型為D2；同時利用Correlation Coefficient方法進行建模波段的選擇，最終確定建模波段為3 031～2 810 cm-1及1 800～1 450 cm-1兩個波段。

2.2.2 模型的建立

按優化的建模條件及建模波段進行建模，在316個樣本集中，葉部位有109個樣品，花部位有105個樣品，全草有102個樣品。在TQ Analyst軟件中利用DM方法、SNV歸一化和二階導數處理進行建模，圖2為五脈綠絨蒿部位判別模型在前三個主成分中的3D顯示圖，其識別率為99.05%、預測率為96.19%。將外部測試集的30份樣品譜圖代入模型中進行驗證，僅1份樣品識別錯誤，外部測試集識別率達到96.67%。

圖2 五脈綠絨蒿部位判別模型前三主成分3顯示D圖Fig.2 Part discriminant model of M.quintuplinervia in 3D on top 3 principal components

從模型3D圖看，該模型可將花部位分出，但葉部位與全草存在部分交叉，Zhao等[11]以五脈綠絨蒿全草的紅外譜圖為參照，利用OMNIC 7.0軟件的質量檢查功能計算花梗、葉、花與全草的相似系數，結果表明全草和葉的相似系數最高；五脈綠絨蒿全草中葉的生物量占比較大，花與根的生物量占比小，以上可能是導致葉部位與全草存在部分交叉的原因。

2.3 模型評價

模型識別性能的評價通過有監督方法進行，通常采用ER、TPR、TNR和F1參數評價。利用式(3)～(6)計算各項參數，結果如表5所示。

表5 不同部位模型識別性能評價參數表Table 5 Evaluation parameters of established model

一個良好的定性模型通常具有低的ER值和高的TPR、TNR和F1值[17]。由表5可知，該模型的ER值在0.02以下，TPR、TNR和F1值在0.97～1.00之間，說明該模型具有較好實用性，可用于快速有效地判別五脈綠絨蒿的不同部位。

3 結論

本研究對五脈綠絨蒿不同部位的中紅外一維平均譜圖進行分析，并建立了一種快速、高效、準確的原藥材部位判別方法。一維平均譜圖中，不同部位的紅外譜圖大體相似，但在2 852和1 385 cm-1處存在差異，且在全譜圖范圍內，全草吸光度普遍高于其它部位，說明花和葉部位中基本不含酯類化合物，且全草中化合物的含量普遍高于其它部位。部位判別模型的建模條件為Distance Match+SNV+D2，建模波段為3 031～2 810和1 800～1 450 cm-1兩個波段，所建模型識別率為99.05%、預測率為96.19%，外部測試集識別率達到96.67%，且識別性能評價良好。該模型具有較好實用性，可用于快速、批量地判別五脈綠絨蒿的不同部位，且對模型使用者的專業性要求不高，有利于在實際生產中推廣應用，在保障用藥安全性及療效方面具有重要意義，可為其他藏藥材資源不同部位的快速識別提供借鑒或參考。