檢測與診斷技術(shù)要點(diǎn)（第二版）（下）

（接上期）

3.3.3 鑒別診斷 非洲豬瘟的臨床表現(xiàn)多樣，嚴(yán)重程度也不一樣，ASF 臨床癥狀與古典豬瘟（CSF）、豬丹毒癥、沙門氏菌病、放線桿菌病、其他敗血癥、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）的臨床癥狀非常類似，有時(shí)候容易混淆（詳見表1）。

3.3.4 發(fā)現(xiàn)疑似病例需采取的行動(dòng) 發(fā)現(xiàn)疑似病例，應(yīng)立即按照《非洲豬瘟防治技術(shù)規(guī)范》和《非洲豬瘟疫情應(yīng)急預(yù)案》要求上報(bào)疫情。

3.4 樣品采集

3.4.1 采樣方法 有效而準(zhǔn)確地采集ASF 樣品是實(shí)現(xiàn)ASF 快速精準(zhǔn)檢測的關(guān)鍵步驟。當(dāng)疫情暴發(fā)（被動(dòng)監(jiān)測）時(shí)，應(yīng)針對患病豬、死亡豬及豬舍環(huán)境進(jìn)行采樣；而在常規(guī)監(jiān)測時(shí)，應(yīng)對ASFV易感豬群及環(huán)境（如出豬臺、場區(qū)大門等風(fēng)險(xiǎn)較大的地方）進(jìn)行采樣；如果是針對精準(zhǔn)清除的群體，采樣的數(shù)量可以適當(dāng)加大。采樣應(yīng)注意避免交叉污染，并在采集每頭豬只后更換一次性手套。觸碰豬只、料槽、欄桿后，應(yīng)及時(shí)更換一次性手套。采血時(shí)，必須做到每采集1 頭豬只更換1 個(gè)新的針頭，以免造成ASFV 傳播。提交到診斷實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)樣品應(yīng)有清晰且保存持久的標(biāo)簽，樣品質(zhì)量良好。所有采樣后的防護(hù)用品必須經(jīng)焚燒或高壓處理。

3.4.2 樣品類型

3.4.2.1 口鼻拭子 將每頭豬口、鼻拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢測的準(zhǔn)確性和減少工作量。拭子裝于Eppendorf管內(nèi)，建議將樣品保存于4 ℃，立刻送檢，沒有實(shí)驗(yàn)條件的應(yīng)在24 h內(nèi)送至有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室。

3.4.2.2 全血 采血過程中應(yīng)保持無菌操作。采血前，先用酒精棉對采血部位進(jìn)行局部消毒。采血完畢，進(jìn)行局部消毒并用干棉球按壓止血。使用含有抗凝血?jiǎng)‥DTA-紫色蓋）的真空采血管從頸靜脈、前腔靜脈或耳緣靜脈抽取全血。如果動(dòng)物已經(jīng)死亡，可立即從心臟中采血。避免使用含肝素的真空采血管（綠色蓋子）。

3.4.2.3 血清 使用未加抗凝劑（紅色蓋子）的真空采血管從頸靜脈、前腔靜脈、耳緣靜脈采血，或剖檢過程收集血液樣品。靜置分離后，收集血清。如果血清是紅色，表明樣品發(fā)生了溶血。通常已經(jīng)死亡動(dòng)物的血液樣品易發(fā)生溶血。

血清樣品在分離后可以立即開展檢測，如果需要儲(chǔ)存，對于抗體檢測，儲(chǔ)存在-20 ℃，但是對于病毒檢測，最好儲(chǔ)存于-80 ℃。

3.4.2.4 器官和組織樣品 可采集脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、扁桃體、心臟、肺和腎臟樣品。脾臟和淋巴結(jié)的病毒含量最高。對于死亡時(shí)間較長的動(dòng)物，可采集骨髓樣品，也可采集關(guān)節(jié)內(nèi)組織液。建議將樣品保持在4 ℃，盡快提交給實(shí)驗(yàn)室。如無法及時(shí)送樣，可將樣品儲(chǔ)存在冷庫或液氮中。樣品用10%緩沖福爾馬林浸泡30 min 以上，病毒可被滅活，可用于PCR檢測。

表1 非洲豬瘟與其他相似豬病的鑒別診斷

樣品的最小需求量：血清1 mL；全血1 mL；組織樣品10 g。

3.4.2.5 環(huán)境樣品 可多點(diǎn)采集養(yǎng)殖場軟蜱等媒介和環(huán)境拭子，如糞便、泔水、飼料等。

3.4.2.6 其他環(huán)境樣品 以區(qū)塊為單位，按風(fēng)險(xiǎn)等級進(jìn)行區(qū)域采樣。豬場內(nèi)所有墻體、地面、設(shè)備等表面進(jìn)行全覆蓋采樣。

生產(chǎn)區(qū)內(nèi)：包括各區(qū)間豬舍內(nèi)所有區(qū)間單元墻體、地面、風(fēng)機(jī)、地溝、設(shè)備、水線、料線、門、窗、濕簾、飲用水等。采樣應(yīng)全覆蓋包括死角、料槽底部等不易采集到的位置。

生產(chǎn)區(qū)外：對可能的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域進(jìn)行采樣，包括地面、草坪、風(fēng)機(jī)口、污水池、發(fā)酵大棚、出豬臺、場區(qū)大門、料塔、下水道、員工宿舍、儲(chǔ)物間、浴室、辦公室、餐廳廚房、車輛、水源等所有可能受到污染的區(qū)域。

場周邊區(qū)：豬場周圍道路。

建議所有樣品在4 ℃以下保存。

3.4.2.7 軟蜱等媒介樣品 鈍緣蜱可以用于檢測ASFV。有三種收集技術(shù)：手動(dòng)收集、二氧化碳誘捕和真空吸引捕捉。收集后，應(yīng)讓蜱保持存活或直接儲(chǔ)存在液氮中，避免DNA降解。

3.4.3 發(fā)生ASF后豬場復(fù)養(yǎng)前的采樣要點(diǎn)

3.4.3.1 采樣位點(diǎn)

（1）全覆蓋采樣：以區(qū)塊為單位，對其內(nèi)部所有墻體、地面、設(shè)備等表面進(jìn)行全覆蓋采樣。

（2）重點(diǎn)位點(diǎn)采樣：作為全覆蓋采樣方法的補(bǔ)充，包括死角、料槽底部等不容易采集到的位置。

3.4.3.2 采樣時(shí)間點(diǎn)

（1）初步清洗完成后采樣檢測，了解當(dāng)前具體污染程度，并為下一步清洗消毒工作提供參考。

（2）徹底清洗完成后采樣檢測，評估清洗效果。

（3）消毒后采樣檢測（細(xì)菌培養(yǎng)＋ASFV核酸檢測），評估消毒效果。

（4）后備豬全面進(jìn)場前采樣檢測。

（5）復(fù)檢檢測。

3.4.3.3 哨兵豬的使用

（1）哨兵豬實(shí)驗(yàn)，是成功復(fù)產(chǎn)的關(guān)鍵。哨兵豬實(shí)驗(yàn)的步驟：選擇一部分動(dòng)物；實(shí)驗(yàn)室檢測確認(rèn)這些動(dòng)物無非瘟病毒和其他主要豬病病原；安排運(yùn)輸，確保運(yùn)輸車輛非瘟病毒陰性；征召愿意在場內(nèi)封閉生活60 d的員工；向場內(nèi)運(yùn)送足夠60 d 使用的飼料；實(shí)驗(yàn)室檢測確認(rèn)飼料和水都是非瘟病毒陰性；運(yùn)送動(dòng)物（數(shù)量約為正常生產(chǎn)時(shí)的5%～10%）；運(yùn)送用的卡車應(yīng)該清洗、消毒并在近期內(nèi)停止使用。

（2）哨兵豬的檢測：哨兵豬飼養(yǎng)期間，進(jìn)行三次檢測，分別在15d、30 d、60 d進(jìn)行病原學(xué)檢測，哨兵豬檢測合格且無臨床癥狀的豬場，才可以考慮進(jìn)行復(fù)養(yǎng)。

3.5 樣品的記錄、保存、包裝和運(yùn)送

3.5.1 注意事項(xiàng) 為保證準(zhǔn)確診斷，必須在適當(dāng)溫度下以最快速度將樣品仔細(xì)包裝，做好標(biāo)記和相關(guān)記錄，以最快路線送到最近的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指定的實(shí)驗(yàn)室。樣品運(yùn)輸必須遵守農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動(dòng)物病原微生物菌（毒）種運(yùn)輸包裝規(guī)范》等規(guī)定。

采樣之前必須致電相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，確保遵循正確的樣品提交程序，保證所送樣品能在第一時(shí)間完成檢測及儲(chǔ)存。

做好樣品運(yùn)輸過程中的安全保障工作，避免在運(yùn)輸途中感染其他動(dòng)物，避免樣品被污染。

運(yùn)送的樣品必須附有足夠數(shù)量的冷卻材料（如冰袋），以防變質(zhì)。

3.5.2 采樣信息記錄

3.5.2.1 采樣同時(shí)，應(yīng)填寫采樣單；采樣單應(yīng)用鋼筆或簽字筆逐項(xiàng)填寫（一式三份）；樣品標(biāo)簽和封條應(yīng)用簽字筆填寫；保溫容器外封條應(yīng)用鋼筆或簽字筆填寫；小塑料離心管上可用記號筆做標(biāo)記；應(yīng)將采樣單和病史資料裝在塑料包裝袋中，并隨樣品送實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)樣品能對應(yīng)到來源動(dòng)物。

3.5.2.2 樣品信息至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：畜主姓名和養(yǎng)殖場地址；養(yǎng)殖場飼養(yǎng)動(dòng)物品種及數(shù)量；疑似或被感染動(dòng)物或易感動(dòng)物種類及數(shù)量；首發(fā)病例和繼發(fā)病例的日期；感染動(dòng)物在畜群中的分布情況；死亡動(dòng)物數(shù)、出現(xiàn)臨床癥狀的動(dòng)物數(shù)量及年齡；臨床癥狀及其持續(xù)時(shí)間，死亡情況和時(shí)間等；飼養(yǎng)類型和標(biāo)準(zhǔn)，包括飼料來源等；送檢樣品清單和說明，包括病料種類、保存方法等；動(dòng)物免疫和治療史；送檢者的姓名、地址、郵編、電話和郵箱；送檢日期；采樣人和被采樣單位簽章。

3.5.3 樣品包裝要求

3.5.3.1 采集好的樣品應(yīng)仔細(xì)進(jìn)行包裝，做好標(biāo)記并送到實(shí)驗(yàn)室。樣品應(yīng)使用“三重包裝系統(tǒng)”，并正確標(biāo)記，以防止泄漏，內(nèi)附采樣單。保障運(yùn)輸過程中的生物安全，并避免樣品受到污染。

3.5.3.2 直接盛裝容器。樣品應(yīng)該儲(chǔ)存在密封、無菌的主容器中，根據(jù)檢驗(yàn)樣品性狀及檢驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的容器。每個(gè)樣品容器外應(yīng)做好標(biāo)記，注明樣品名、樣品編號、采樣日期等，要能明確識別來自于哪只動(dòng)物。

3.5.3.3 二次包裝。吸收材料也應(yīng)放置在二次容器內(nèi)。如果將多個(gè)易碎的主容器放置在單個(gè)二次容器中，則必須單獨(dú)包裝或分離，以防止相互接觸。二次包裝容器應(yīng)貼封條，封條上應(yīng)有采樣人簽章，并注明貼封日期，標(biāo)注放置方向。

3.5.3.4 堅(jiān)硬的外部包裝。外包裝在盛裝液體的情況下不得超過4 升，在固體物質(zhì)的情況下不得超過4 kg（不包括冰的重量）。樣品必須保持4 ℃溫度或更低溫度，并就近送動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)進(jìn)行保存。注意：切勿凍結(jié)全血或混合有血凝塊的血清。

外包裝標(biāo)簽和標(biāo)記：“B類感染物質(zhì)”標(biāo)簽，其正確的運(yùn)輸名稱旁邊標(biāo)注“B 類感染物質(zhì)”；采樣負(fù)責(zé)人的全名、地址和電話號碼；實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系人的全名、地址和電話號碼；標(biāo)簽上標(biāo)明“在4 ℃”、“在-20 ℃”或“在-80 ℃”保存。

3.6 廢棄物處理 采樣結(jié)束后，做好動(dòng)物尸體、場地、物品、個(gè)人防護(hù)用品的消毒和無害化處理。對不同場點(diǎn)盡量安排不同的采樣人員，避免交叉污染。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷與確診

4.1 快速精準(zhǔn)檢測（表2）

表2 非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

4.1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測 這是實(shí)驗(yàn)室快速檢測ASFV 的常用方法。大型養(yǎng)豬企業(yè)可建設(shè)ASFV 檢測實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)豬場周邊和自己豬場受到威脅時(shí)做好疫情排查與監(jiān)測，為疫情處置和精準(zhǔn)清除提供技術(shù)支撐。開展qPCR 檢測必須配備專用的實(shí)時(shí)熒光PCR 儀和相應(yīng)檢測試劑。實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)開展ASFV 的qPCR 檢測。由于qPCR 檢測技術(shù)靈敏，極其微量的污染即可造成假陽性，對PCR 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分區(qū)管理可以避免檢測污染。應(yīng)根據(jù)條件將PCR 實(shí)驗(yàn)室分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)等。

4.1.2 ASFV 抗體檢測 由于沒有疫苗，抗體的存在表明當(dāng)前或過去有感染。對于急性疾病的暴發(fā)，病毒檢測（PCR）最有用，血清學(xué)診斷價(jià)值較低，因?yàn)榇蠖鄶?shù)豬在抗體反應(yīng)前死亡，在7～10 d內(nèi)；但是如果存在幸存的豬只，特別是ASFV轉(zhuǎn)變?yōu)橹械榷玖蛘呷醵玖Χ局曛螅贵w檢測的作用凸顯。CISA-INIA 指出，在ASF 呈地方流行的區(qū)域，確診可疑病例最好用標(biāo)準(zhǔn)的血清學(xué)試驗(yàn)（ELISA），結(jié)合另一種血清學(xué)試驗(yàn)（IFA）或抗原檢測試驗(yàn)（FAT）。

抗體檢測的樣品類型：血清（避免溶血）、血漿、豬肉浸出液、組織滲出物、口腔液（取樣方便，無創(chuàng)，但抗體水平低于血清）。建議在處理和檢測前加熱滅活血清中的ASF 病毒，OIE 推薦：56 ℃70 min或60 ℃20 min。

4.2 疫情確診 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心或省級動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室可以按要求確診ASF疫情。

（全文完）