一株高效降解青霉素菌的篩選及鑒定

王禮君 ， 馮麗妍 ， 徐建中 *， 張偉國

（1.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

青霉素作為一種高效、廣譜的抗生素具有很強的抑菌殺菌作用，但是在實際生活中，特別是醫療和畜禽養殖業很容易過度使用而導致抗生素滲入環境介質中，進而影響環境微生物群的結構和活性，誘導產生各類抗生素耐藥菌[1-2]。當前，國內外在城市污水、養殖場廢水與土壤中都有檢測到較高的抗生素殘留，因此從源頭上控制抗生素的使用，以及在對含抗生素的廢渣廢液進行排放前進行高效的處理顯得尤為重要。此外，我國是世界上最大的青霉素生產國和出口國，會產生大量的青霉素菌渣，傳統處理中菌渣作為廢棄物進行填埋或者焚燒處理，浪費了大量有機資源，且不能有效處理掉菌渣中殘留的青霉素，對環境存在巨大的潛在威脅。目前，我國還沒有完整且成熟的化學集中處理工藝，且耗資較大，不適用于菌渣大規模的處理。相比之下，利用堆肥化處理青霉素菌渣，通過堆肥過程中微生物作用降解殘留青霉素，擁有綠色、環保、經濟、處理方式簡單等優點。因此，從土壤或菌渣中篩選得到一種具有高效降解青霉素能力的菌株，將極大地縮短堆肥化的時間，提高菌渣中殘留青霉素降解效率，不僅實現了菌渣的無害化處理，還對菌渣的進一步回收利用具有極大的實際意義和經濟價值。

國內已有部分關于降解青霉素的研究，例如岳喜慶[3]等分離出一株能高效降解青霉素鈉的菌WM1，在菌株接種體積分數為10%并以青霉素鈉為惟一碳源的條件下，培養9 h對初始質量濃度為10 mg/L的青霉素鈉的降解率達到100%；付歡[4]等篩選出一株對青霉素具有高效降解能力的菌JZ6，在培養條件為30℃、pH 6.7并且外加碳氮源的條件下，培養24 h可以對初始質量濃度為300 mg/L的青霉素的降解率達到99.98%；趙娟[5]等分離出一株具有高效降解青霉素能力的菌PC-2，在接種體積分數為14%，培養溫度為37℃、pH 7.0左右的培養條件下，外加碳氮源，培養6 h可使菌株對初始質量濃度為400 mg/L的青霉素的降解率達到98%。已研究菌株對青霉素的抗性較低，降解效率雖然可在較短時間內達到99%，但青霉素初始質量濃度較低，無法滿足工業特別是一些含有較高質量濃度的青霉素的菌渣的初步處理要求，限制了菌株在實際生產生活中的應用。

作者通過從青霉素鈉生產企業附近的土壤樣品中分離篩選出具有較高青霉素鈉抗性的菌株，考察菌株對青霉素鈉的降解能力，并探究菌株在一定條件下的最佳降解條件，以期得到一種高濃度的青霉素鈉的高效降解菌。此菌株可用于處理含有較高濃度的青霉素鈉的菌渣、工業廢水及農場廢棄物等，帶來更大的實際效益，實現安全、高效的排放。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品為取青霉素生產企業附近的土壤若干，青霉素鈉160萬單位，華北制藥集團生產。主要儀器有電子顯微鏡、紫外可見光分光光度計、高效液相色譜儀、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等。

1.2 主要培養基

LBG培養基：葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至 1 000 mL，pH 7.0。

降解培養基：KH2PO43 g，K2HPO41 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 2 mg，MnSO42 mg，FeSO4·7H2O 2 mg，CaCl21 mg，碳源 5 g，氮源 5 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

培養基于121℃滅菌20 min，如要制成固體培養基則向培養基中加入終質量濃度為20 g/L的瓊脂條。對于降解培養基，青霉素鈉溶液過濾除菌后按一定終質量濃度添加。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定

1）降解青霉素鈉菌株的富集和分離 稱取樣品土壤各10 g，分別放入裝有100 mL無菌水和一層玻璃珠的錐形瓶中，100 r/min搖床振蕩15 min，充分打散，制成菌懸液，取蒸餾水稀釋至10-4～10-6倍，取菌懸液150 μL涂布到含青霉素鈉質量濃度為5 g/L的LBG培養基上，置于30℃恒溫培養箱中培養48 h。挑取生長良好的菌株逐步轉接至含青霉素鈉質量濃度為 10、15、20、30 g/L 的 LBG 培養基上，選擇能耐受較高質量濃度的青霉素鈉的菌株進行分離純化。通過對菌落菌體的形態特征觀察初步確定菌株的種屬。

2）全基因組的提取及18S rRNA的擴增 全基因組的提取采用康為世紀酵母基因組DNA提取試劑盒。使用通用引物ITS1和ITS4對菌株的18S rRNA進行PCR擴增，PCR產物測序由通用生物系統（安徽）有限公司完成。

3）序列同源性比對及系統發育樹的構建 根據測序結果在NCBI中進行Blast比對，并在MEGA 7.0軟件中用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，并進行1 000次Bootstraps檢驗。

1.3.2 青霉素鈉降解菌株生長曲線的測定 挑取1～2環菌株接入LBG培養基中，30℃搖瓶培養至菌液渾濁后以1%接種體積分數接入降解培養基中，并于最適生長條件下進行搖瓶培養，定時取樣測定菌液的OD600值。

1.3.3 青霉素鈉降解菌降解效率的測定

1）樣品制備與液相色譜條件 向基礎培養基中加入終質量濃度為10 g/L的青霉素鈉，含有最佳碳氮源的降解培養基記作第一組，不加入碳氮源的降解培養基記作第二組。取于最佳生長條件下培養32 h的發酵液1 mL加入4 mL緩沖液 （乙腈∶水=4∶1）中，混勻后10 000 r/min高速離心10 min，上清液進行液相處理。色譜檢測條件為225 nm，進樣量20μL，流速 0.5 mL/min，流動相選用V（磷酸二氫鉀（pH 3.5））∶V（甲醇）=38∶62[6]。

2）青霉素鈉溶液標準曲線的測定 青霉素鈉溶液的標準質量濃度曲線：用降解培養基作為溶劑配置不同質量濃度的青霉素鈉溶液并作3個平行樣，在相同色譜條件下進樣，以青霉素鈉質量濃度為橫坐標，對應色譜圖的峰面積為縱坐標繪制青霉素鈉質量濃度的標準曲線。

1.3.4 接種體積分數對降解效率的影響 在含有青霉素鈉終質量濃度為10 g/L的降解培養基中分別接種體積分數1%、5%、10%、15%、20%、30%的菌液，于30℃的恒溫搖床中培養，取24 h的菌液進行液相色譜分析。

1.3.5 青霉素鈉的初始質量濃度對降解效率的影響 在已知最佳菌株接種體積分數的降解培養基中，加入終質量濃度分別為 5、10、15、20、30、40 g/L的青霉素鈉，于30℃的恒溫搖床中培養，取24 h的菌液進行液相色譜分析。

1.3.6 培養時間對降解效率的影響 確定出菌株的最佳接種體積分數和青霉素鈉的初始質量濃度后，在該條件于30℃的恒溫搖床中培養，分別取12、24、36、48、60、72、84 h 的菌液進行分析，探究培養時間對降解效率的影響。

1.3.7 Anti-Pen20降解青霉素鈉的產物分析 取菌株在降解培養基中培養24 h的發酵液進行液相色譜-質譜聯用技術分析，確定菌株降解青霉素鈉的產物。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的初步鑒定結果 將土壤樣品中的菌株涂布在含有質量濃度為5 g/L青霉素鈉的LBG培養基上，培養后挑選出8株耐藥菌株，分別編號為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8， 通過劃線分離純化再逐步提高培養基中青霉素鈉的質量濃度至30 g/L，以及后期對各菌株降解青霉素鈉效率的比較，最終在青霉素鈉的質量濃度為20 g/L的LBG培養基上挑選出一株生長良好的青霉素鈉高效降解菌株J4，命名為Anti-Pen20。對Anti-Pen20的劃線分離結果見圖1（a）。在LBG固體培養基上菌落呈橙紅色且具有光澤，圓形，邊緣光滑，易挑起。從電鏡圖片1（b）中可以看到菌株Anti-Pen20為橢圓形，無鞭毛，菌體表面光滑，有出芽現象，菌體長5μm，寬3μm左右。

圖1 菌株Anti-Pen20的菌落特征及電鏡掃描圖Fig.1 Colony characteristics and electron microscope scans of strain Anti-Pen20

2.1.2 菌株的分子鑒定結果 經初步的生理生化鑒定菌株Anti-Pen20為酵母菌屬，采用康為世紀酵母基因組DNA提取試劑盒提取Anti-Pen20的全基因組，通過PCR擴增獲得菌株的18S rRNA基因的目的片段，由瓊脂糖凝膠電泳顯示片段的大小約為700 bp左右，見圖2。對PCR產物純化后進行測序，測序結果顯示，菌株Anti-Pen20的18S rRNA長度為621 bp，其序列如下：

圖2 18S rRNA PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification of 18S rRNA

將測序結果在NCBI上進行序列比對，發現菌株Anti-Pen20 與粘質紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的序列同源性在99%以上，通過MEGA7軟件中的Neighbor-Joining分析方法構建出菌株的系統發育樹圖[7-8]，見圖3。菌株Anti-Pen20已保藏在中國典型培養物保藏中心 （China Center for Type Culture Collection，簡稱 CCTCC），菌種保藏登記號為：CCTCC M 2018202。

目前部分關于粘質紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的研究表明，粘質紅酵母表現出良好的拮抗酵母特性，其能在水果表皮上生長而對由病菌引起的水果病變表現出顯著的拮抗效果[9-10]，可以控制并降解水果及其制品中的展青霉素[11]。另有報道表明，粘質紅酵母可通過添加至魚類、家禽類的養殖飼料中來增強養殖動物的抗病性，提高產品質量[12-13]。

2.2 菌株Anti-Pen20的生長曲線

圖4為菌株Anti-Pen20在降解培養基中的生長曲線圖，生長溫度為30℃，pH 7.0，恒溫搖床轉速100 r/min。由圖4可以看出，Anti-Pen20在前8個小時內生長較慢，培養的第8～16小時為菌株的生長對數期，在培養20 h后進入了生長穩定期。

圖3 菌株Anti-Pen20的系統發育樹圖Fig.3 Phylogenetic tree of strain Anti-Pen20

圖4 Anti-Pen20的生長曲線圖Fig.4 Growth curve of Anti-Pen20

2.3 接種體積分數對降解效率的影響

在培養基中青霉素鈉初始質量濃度為10 g/L、30℃恒溫搖床培養24 h的條件下，不同接種體積分數Anti-Pen20菌液的青霉素鈉降解率見圖5。從圖5可知，青霉素降解率在接種體積分數為1%～15%區間逐步上升，但在接種體積分數超過15%時，降解率顯著降低，因此菌株Anti-Pen20降解青霉素鈉的最佳接種體積分數為15%。

2.4 青霉素鈉的初始濃度對降解效率的影響

在確定接種體積分數為15%的條件下，向培養基中加入不同質量濃度的青霉素鈉溶液，在30℃恒溫搖床中培養24 h，得到的降解結果見圖6。從圖6可知，在測試的青霉素鈉質量濃度為5～20 g/L范圍內，菌株Anti-Pen20對青霉素鈉的降解率都保持較高水平，其中青霉素鈉質量濃度為20 g/L時的降解率達到85%。然而，但青霉素鈉質量濃度大于20 g/L時，降解率顯著下降，其原因可能是高質量濃度的青霉素鈉溶液抑制了菌株的生長，從而影響青霉素鈉的降解。因此，確定菌株Anti-Pen20最佳青霉素鈉降解質量濃度為20 g/L。

圖5 接種體積分數對降解效率的影響Fig.5 Effect of inoculum size on degradation efficiency

圖6 青霉素鈉的初始質量濃度對降解效率的影響Fig.6 Effect of initial concentration of penicillin sodium on degradation efficiency

2.5 培養時間對青霉素鈉降解效率的影響

菌株Anti-Pen20在接種體積分數為15%，青霉素鈉初始質量濃度為20 g/L的條件下，在前24小時內的降解青霉素鈉的速率較快，12 h時降解率可達41%，24 h降解率可達83%，而在24 h后青霉素鈉降解率雖然仍在增加，但降解速率顯著下降，見圖7，這可能與培養基中營養物質的消耗、代謝產物的的積累有關[15-16]。

2.6 菌株Anti-Pen20降解青霉素鈉的產物分析

將菌株Anti-Pen20在降解培養基中培養24 h后的發酵液處理后進行液質聯用分析，得到的質譜圖見圖8。由物質的質荷比聯系物質的分子結構分析可知，產物中存在著青霉素的幾種標志性降解產物，主要有青霉素噻唑酸及去羧青霉素噻唑酸，符合β-內酰胺酶作用的降解產物，見表1[17]。

圖7 培養時間對青霉素鈉降解率的影響Fig.7 Effectofculture time on penicillin sodium degradation rate

圖8 降解產物二級質譜圖Fig.8 Secondary spectra of degradation products

表1 Anti-Pen20降解青霉素鈉的主要產物Table 1 Main degradation products of penicillin sodium

3 結 語

從青霉素鈉生產企業附近的土壤中篩選出一株具有青霉素鈉抗性的菌株Anti-Pen20，通過生理生化以及分子水平鑒定，發現該菌與粘質紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的序列同源性超過99%。通過高效液相色譜分析作圖，發現青霉素鈉在10 g/L范圍內響應峰的峰面積與青霉素鈉質量濃度高度契合一級反應動力學方程式y=244.21x+1.608 7，其中y表示液相色譜響應峰面積，x表示青霉素鈉質量濃度，R2=0.999 9。優化降解條件后發現，Anti-Pen20降解青霉素鈉的最佳接種體積分數為15%，青霉素鈉的最佳質量濃度為20 g/L，隨著培養時間的增加，菌株對青霉素鈉降解效率逐漸降低。通過對Anti-Pen20降解青霉素鈉的產物進行質譜分析，發現產物中主要有青霉素噻唑酸及去羧青霉素噻唑等。

Anti-Pen20所具有的高效降解青霉素鈉的能力以及粘質紅酵母本身的特性，有望應用于具有高質量濃度青霉素鈉菌渣的處理回收，也可以為Anti-Pen20在動物飼料添加劑以及果業中作為防病變添加劑的應用提供研究依據。