槐榆顆粒質量標準研究

劉明智 ，梁 宏 *，易徐航 ，郝 旭

（1.萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗所，江西 萍鄉(xiāng) 337000；2.萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

槐榆顆粒是萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院應用多年的純中藥制劑，是依據(jù)江西名老中醫(yī)、萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院主任中醫(yī)師王德祖提供的臨床經(jīng)驗方研制而成。槐榆顆粒具有清熱利濕、活血化瘀、止血鎮(zhèn)痛、通利二便等功效，臨床應用于痔瘺、肝周皮膚疾病、結腸炎等見上述證候者。槐榆顆粒質量控制所依據(jù)的現(xiàn)行標準為《江西省食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機構制劑》GZJ-0302-（1）-2006，檢驗項目包括“性狀”“鑒別”“檢查”，無含量測定項，為了有效控制其質量，保障其臨床療效，該制劑標準亟待提升。槐花是槐榆顆粒處方中的主要飲片，具有清熱解毒，涼血止血的藥效，常用于治療血熱妄行所引起的各種出血證、肝火上炎之目赤、頭痛眩暈等［1］，成分主要包括黃酮類、皂苷類、脂肪酸類、多糖類、揮發(fā)性成分等［2］。黃酮類物質蘆丁是槐花的主要活性成分，具有降血壓、降血脂、抗過敏及抗炎等作用［3］，與槐花功效主治吻合，且在槐花中含量較高，其含量的測定被多次報道［4-5］。本研究采用薄層色譜法分別對槐榆顆粒中槐花、地榆、延胡索進行定性鑒別；同時采用高效液相色譜法測定槐榆顆粒中蘆丁的含量，為槐榆顆粒質量標準的提升提供良好的基礎與依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ME-204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；CP225D型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥 蘆丁對照品（批號：100080-201811，HPLC測定含量以91.7%計）、槐花對照藥材（批號：121063-201804）、地榆對照藥材（批號：121286-201703）、延胡索對照藥材（批號：120928-201609），均來源于中國食品藥品研究檢定院；槐花 （批號：1810006）、秦艽（批號：1811007）、延胡索（批號：1811011），均購自樟樹市慶仁中藥飲片有限公司；地榆（批號：1808004）、澤瀉（批 號：1812012）、防風（炭）（批號：1812010）、當歸（批號：1811012）、生地黃（批號：1812012）、黃柏（批號：1810011）、熟大黃（批號：1810004）、桃仁（批號：1812007）、檳榔（批號：181108），均購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司；槐榆顆粒由萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院制劑室提供，生產(chǎn)批號分別為：20190802、20190704、20190605、20190504、20190304、20190105；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 槐花的定性鑒別 取本品10 g，研細，加甲醇25 mL，超聲處理40 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3 mL使溶解，作為供試品溶液。另取槐花對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法［6］進行試驗，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶2∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置碘蒸氣中熏數(shù)分鐘后，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照溶液在相應的位置沒有斑點，見圖1。

2.1.2 地榆的定性鑒別 取本品13 g，研細，加15%（V／V）硫酸溶液 50 mL，振搖后加三氯甲烷 50 mL，回流2 h，放冷，濾過，分取三氯甲烷液并濃縮至約2 mL，作為供試品溶液。另取地榆對照藥材5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法［6］進行試驗，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-環(huán)己烷（3∶3∶4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 25%（g／mL）磷鉬酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照溶液在相應的位置沒有斑點，見圖2。

2.1.3 延胡索的定性鑒別 取本品9 g，研細，加濃氨水-環(huán)己烷（2∶1）30 mL，超聲處理 30 min，取上清液，作為供試品溶液。另取延胡索對照藥材3 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法［6］進行試驗，吸取上述兩種溶液各15 μL，分別點于同一硅膠HF254 薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇（6∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照溶液在相應的位置沒有斑點，見圖3。

2.2 蘆丁的含量測定

2.2.1 色譜條件 Waters symmtery shield Rp18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，以1%（V／V）的冰醋酸溶液為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為257 nm；柱溫 25 ℃；流速為 1.0 mL／min；進樣量為 10 μL。理論板數(shù)按蘆丁峰計算均應不低于2 000。

表1 色譜條件梯度洗脫程序

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下本品內容物，混勻，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率 250 W，25 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，即得。

2.2.2.3 陰性（槐花）對照樣品溶液的制備 取地榆 42 g，秦艽 33 g，澤瀉 42 g，防風（炭）42 g，當歸42 g，延胡索 42 g，生地黃 42 g，黃柏 28 g，熟大黃28 g，桃仁 28 g，檳榔 28 g。共 11味藥，加水煎煮2次，第1次煎煮2 h，第2次煎煮1 h，煎液合并，濾過。濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25（60℃），加乙醇使含醇量達60%，靜置48 h，取上清液回收乙醇，濃縮至相對密度為1.28～1.32（60℃）的浸膏，加入輔料適量，混勻，制成顆粒，干燥，制成100 g。按“2.2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備陰性（缺槐花）對照品樣品溶液。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 系統(tǒng)適用性實驗 取對照品溶液、供試品溶液及對照樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，比較對照品色譜、供試品溶液色譜及對照樣品溶液色譜，結果供試品中蘆丁色譜峰與雜質色譜峰分離良好，主峰理論踏板數(shù)按蘆丁計為190 215，見圖4。

2.2.3.2 線性關系的考察 精密稱取蘆丁對照品10.06 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品母液。再用相同溶劑分別稀釋至濃度為 12.6、25.2、50.3、100.6、201.2 μg／mL的溶液，作為對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標進行線性回歸，得線性方程Y＝18.675X－2.486 1，r＝0.999 9。 其中 X 為峰面積（mAU·s），Y 為蘆丁的濃度（μg／mL）。結果顯示蘆丁在0.126～2.012 μg之間呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.2.3.3 精密度試驗 精密吸取對照品（含蘆丁50.3 μg／mL），按“2.2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，結果蘆丁峰面積的RSD為0.17%。表明精密度良好。

2.2.3.4 重復性試驗 取同一批號（批號20190105）樣品共6份，精密稱定，按“2.2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備對照品溶液和供試溶液，照“2.2.1”項下色譜條件測定測定蘆丁的含量，計算得蘆丁含量的RSD為0.20%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.3.5 準確度試驗 采用加樣回收試驗，精密稱取已知含量的本品（批號 20190105）約 0.65 g，置具塞錐形瓶中，精密加入“2.2.3.2”項下含蘆丁50.3 μg／mL的對照品溶液 10 mL和 60%甲醇 15 mL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結果見表2。

表2 蘆丁回收率試驗結果（n＝6）

2.2.3.6 穩(wěn)定性 精密吸取供試品溶液（批號2019 0105），分別在 0、2、4、6、8、12 h 進樣，按“2.2.1”項下色譜條件記錄蘆丁峰面積，結果供試品溶液中蘆丁12 h內峰面積無明顯變化，蘆丁RSD為0.24%（n＝6），表明樣品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.2.3.7 樣品測定 取本品6批，照“2.2.1”項下方法試驗，測定結果見表3。

表3 樣品測定結果

3 討 論

3.1 高效液相色譜條件的選擇 蘆丁的結構式中含有羥基，在色譜條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，以1%（V／V）冰醋酸溶液為水相可有效改善主峰的拖尾因子，且能獲得更好的分離度。由于蘆丁的保留時間過長，改用梯度洗脫程序，保留時間縮短且峰形得到進一步改善。使用DAD（二極管陣列檢測器）進行紫外全波長掃描（190～440 nm）發(fā)現(xiàn)，257 nm波長處蘆丁有最大吸收，在此波長下主峰有良好的信號響應，基線噪音小。

3.2 提取方法的選擇 黃酮類物質一般不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷等有機溶劑［7］，本文考察了不同濃度的甲醇溶液（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇）和不同超聲提取時間（10、20、30、40、60 min）對槐榆顆粒中蘆丁提取效果的影響，確定以甲醇為溶劑超聲提取（功率250 W，25 kHz）30 min為最優(yōu)條件。

3.3 槐榆顆粒質量探討 由“2.2.3.7”項結果得知，不同批次的槐榆顆粒中蘆丁含量差異顯著，這主要是購進的槐花飲片的質量差異所導致的。制劑的質量勢必影響臨床療效，制劑的質量又取決于飲片的質量，中醫(yī)臨證處方歷來就講究中藥的道地性，因此中藥制劑應將中藥飲片的質量控制放在首位。

本研究采用薄層層析法對槐榆顆粒進行定性鑒別，操作簡單，重現(xiàn)性好，為槐榆顆粒的質量控制提供了有效的鑒別手段；建立的HPLC法測定槐榆顆粒中蘆丁含量方法，經(jīng)方法學驗證，該方法準確、高效，專屬性強，重現(xiàn)性好，可用于槐榆顆粒的質量控制，并將為槐榆顆粒標準的進一步提升提供重要的參考。