水中銅綠假單胞菌的能力驗證關鍵點控制

譚慧林 金永生 吳忠紅

摘 要：通過參加水中銅綠假單胞菌能力驗證，提高實驗室檢驗能力，總結實驗過程中的關鍵點控制，討論應用國家標準GB 8538-2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》檢驗銅綠假單胞菌存在的問題。

關鍵詞：銅綠簡單胞菌;國家標準;檢驗;關鍵點

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種常見的條件致病菌，水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道都有此菌存在。此菌喜歡潮濕的環境。食品中主要在飲用水中存在，人飲用含有銅綠假單胞菌污染的飲用水后會導致食源性疾病，對免疫力低下或喪失免疫力的患者來說具有較高的致病風險。近年來，包裝飲用水憑借飲用方便、水質潔凈等優勢，迅速進入了家庭及辦公場所，國內外關于包裝飲用水受銅綠假單胞菌污染的報道也日漸增多[1]。所以應加強對包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢驗，而檢驗準確是保證食品安全的有力手段。

能力驗證是利用實驗室間比對來確定實驗檢測能力的活動，是實驗室質量控制的重要手段。它是確保實驗室檢測結果準確性和提高檢測水平的重要手段。為提高本中心微生物室檢驗能力，增強本中心市場競爭力，本中心微生物室參加了中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測能力驗證，本實驗室采用國家標準GB 8538-2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》進行檢驗。通過本次能力驗證，發現國家標準GB 8538-2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》存在的描述問題，提出解決方案，為準確計數銅綠假單胞菌提出操作指導。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供（編號為19-P370、19-Q883）;銅綠假單胞菌（ATCC 27853）購自環凱微生物科技有限公司。

1.2 試劑

假單胞菌瓊脂基礎培養基（CN）、營養瓊脂、氧化酶試紙、乙酰胺肉湯、鈉氏試劑、綠膿菌素測定培養基（北京陸橋技術股份有限公司）;0.45 μm濾膜與濾杯（環凱）。

1.3 儀器

生化培養箱（美墨爾特）;多聯過濾系統（環凱微生物科技有限公司）;高壓滅菌器（施都凱儀器設備公司）暗箱式自動紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 樣品處理

根據ASAC-PT551（2018）礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測能力驗證作業指導書處理樣品，在生物安全柜中打開西林瓶，從已滅菌的520 mL無菌水中吸取5 mL無菌水，溶解西林瓶中的樣品，將西林瓶中的水靠近火焰傾注到無菌的1 000 mL三角瓶中，重復此操作3次，同時用移液槍吸取5 mL無菌水沖洗西林瓶蓋于無菌的

1 000 mL三角瓶中，最后將剩余的無菌水全部傾注到無菌的1 000 mL三角瓶中，能力驗證作業指導書稱此溶液為原液。從原液中吸取25 mL置于225 mL無菌水，渦旋1 min，此溶液為1∶10稀釋液，從稀釋液中吸取25 mL置于225 mL無菌水中，渦旋

1 min，此溶液為1∶100稀釋液。在日常實驗中，銅綠假單胞菌污染程度比較嚴重，CN板上比較多，不容易準確計數，所以選取3個濃度檢測此次能力驗證樣品中的銅綠假單胞菌[2]。

2.2 樣品過濾與培養

在過濾泵頭放置無菌的0.45 μm的濾膜，光面朝上，取250 mL原液、1∶10稀釋液、1∶100稀釋液加入到250 mL的濾杯中真空隔膜泵過濾，過濾杯中的待測液和稀釋液全部過濾后，用無菌水沖洗過濾杯3次，將過濾后的濾膜貼平鋪在CN瓊脂平皿上，正面朝上且不能有氣泡。將貼好濾膜的CN瓊脂平皿倒置放入到36 ℃培養箱中培養。

2.3 觀察

培養24 h后觀察培養基，記錄菌落形態，24 h后培養基上有菌落長出，計數菌落。再培養24 h，記錄菌落形態，發現此時許多菌落開始生長，有的已經連在一起，有的菌落此時產綠膿，菌落顏色為綠色，有的菌落為無色、乳白色、淡綠色或黃色。

2.4 可以菌落的驗證

每個平板挑取在紫外燈下產熒光的菌落10個，在營養瓊脂上純化培養18 h，做氧化酶實驗，同時接種到乙酰胺肉湯中在36 ℃西安培養24 h后，添加2滴納氏試劑后觀察乙酰胺肉湯管中顏色變化（顏色由深黃色到磚紅色則為陽性，其余為陰性）。綠色的菌落接種到綠膿菌素測定培養基中在

36 ℃下培養24 h，加入三氯甲烷

3～5 mL，三氯甲烷呈粉紅色到紫紅色。選取的產熒光的20個菌落氧化酶為陽性，乙酰胺肉湯為陽性，綠膿菌素為陽性。

3 結果

通過在CN培養基上在36 ℃下培養24 h計數所有產熒光的菌落，48 h后再次記錄產綠和產熒光的菌落，選擇產熒光的菌落進行氧化酶實驗、乙酰胺肉湯實驗，對產綠膿的菌進行綠膿菌素驗證實驗，本實驗報出此次能力驗證結果19-P370為21 000 CFU/250 mL，19-Q883為19 000 CFU/250 mL。19-P370的Z值為0.6，19-Q883 Z值為0.8，能力驗證結果為滿意。

4 討論

能力驗證是實驗室外部質控的手段之一，通過參加能力驗證可提高檢驗員的檢驗水平和實驗室檢驗能力。本中心此次能力驗證結果為滿意。通過參加能力驗證本實驗室發現了國家標準GB8538-2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》檢驗銅綠假單胞菌中存在的問題，總結檢驗銅綠假單胞菌的關鍵點，指導日常實驗工作。

（1）國家標準中檢驗水中銅綠假單胞菌時沒有要求稀釋樣品，在日常檢驗中發現，檢驗污染較嚴重的水時，銅綠假單胞菌在過濾膜上生長的很多，無法計數，應該對其進行稀釋，是從25 mL稀釋到225 mL。

（2）乙酰胺肉湯的判讀，國家標準中銅綠假單胞菌在乙酰胺肉湯中培養24 h后，加入納氏試劑后，顏色由深黃色到磚紅色。實驗中發現空白乙酰胺肉湯加入納氏試劑后最終也能變為磚紅色。實驗中發現水中存在銅綠假單胞菌時，只要加入納氏試劑立即就會變為磚紅色。

（3）國家標準要求菌落為綠色時，需要做綠膿素測定實驗，在日常實驗中發現，在CN上綠色的菌，綠膿菌素均為陽性。

（4）可疑菌的純化生化鑒定。國家標準要求盡可能將所有經濾膜過濾后的可疑菌落在營養瓊脂上純化培養后進行生化鑒定。如果水污染嚴重，進行純化鑒定的工作量非常大，且沒有必要。本中心參照GB4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》第二法中大腸菌群的生化鑒定：挑取10個可疑菌落進行生化分析，根據比例計算銅綠假單胞菌個數。

（5）CN培養基培養24 h時需要記錄產熒光的菌落，日常實驗中發現銅綠簡單胞菌在CN培養基上培養24 h后可以產熒光，但產生綠膿素需要48 h，但CN培養48 h，銅綠假單胞菌會變大，菌落之間會粘連，不易計數。本中心在實驗中選擇24 h計數一次，48 h計數一次，觀察產綠膿情況。

參考文獻

[1]蘇粉良，徐振東，陳雨欣.蘇州市包裝飲用水中銅綠假單胞菌污染調查[J].江蘇預防醫學，2019，5（30）：326-327.

[2]王燕梅，唐震，喬昕，等.江蘇省桶裝飲用水中銅綠假單胞菌污染情況調查[J].中國衛生檢驗雜志，2015，25（12）：2019-2020.