荷葉鐵線蕨的無(wú)菌條件下誘導(dǎo)原葉體

望雄英

（長(zhǎng)江珍稀植物研究所，湖北 宜昌 443100）

1 材料與方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)采用的是成熟未開裂的荷葉鐵線蕨孢子，采自植物所溫室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）無(wú)菌播種。利用75%酒精對(duì)收集的成熟且未裂開的孢子表面進(jìn)行消毒，每次30s，然后進(jìn)行5min0.1%的升汞（HgCl2）的消毒，利用無(wú)菌水進(jìn)行5～6 次沖洗，表面水分的吸取采用無(wú)菌濾紙。然后放置在無(wú)菌環(huán)境中，利用經(jīng)消毒的無(wú)菌鑷子將孢子夾起放置于培養(yǎng)基上方，立即將瓶蓋蓋好，并進(jìn)行標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行為5d 的暗培養(yǎng)，然后將其放置于培養(yǎng)室，調(diào)整培養(yǎng)溫度大約為（25±2）℃，光照度設(shè)定為2000～2500lx，光照每日12h。

本次實(shí)驗(yàn)主要設(shè)計(jì)了培養(yǎng)基6 組，并以此為基礎(chǔ)設(shè)置2 個(gè)不同pH 的實(shí)驗(yàn)組，pH 分別設(shè)置為5.8 與7.0，總計(jì)進(jìn)行培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)的有6 組。

表1 孢子萌發(fā)培養(yǎng)基

（2）孢子誘導(dǎo)。無(wú)菌條件下，向不同孢子體誘導(dǎo)基質(zhì)中轉(zhuǎn)接孢子體，其直徑為0.5cm，每種培養(yǎng)基配置數(shù)量為10 瓶。培養(yǎng)溫度調(diào)整為大約（25±2）℃，光照調(diào)整為2000～2500lx，光照時(shí)間為每日16h。孢子體誘導(dǎo)基質(zhì)是以無(wú)菌條件下，添加不同基質(zhì)，其中基質(zhì)設(shè)置了4 種配比，詳情如表2 所示。從表2 可見，基質(zhì)為泥炭；珍珠巖=6：1 時(shí)誘導(dǎo)率最高，原葉體具有良好的長(zhǎng)勢(shì)，且具有較高的誘導(dǎo)率，同其他不同基質(zhì)培養(yǎng)的苗相比更加健壯，顏色呈鮮綠色。若河沙數(shù)量較多，則會(huì)降低原葉體誘導(dǎo)系數(shù)，苗徑較小，而且顏色呈黃色。

2 結(jié)果

2.1 孢子無(wú)菌萌發(fā)

在培養(yǎng)基上放置孢子進(jìn)行培養(yǎng)，20d 后，出現(xiàn)顯著萌發(fā)現(xiàn)象，孢子吸收膨脹，從黃褐色向綠色轉(zhuǎn)變，27d 后，可以發(fā)現(xiàn)孢子呈綠色小蘑菇狀，即孢子體。

表2 基質(zhì)對(duì)孢子誘導(dǎo)的影響

根據(jù)孢子萌發(fā)數(shù)量分析，培養(yǎng)基中，4 號(hào)和6 號(hào)孢子萌發(fā)率較其他培養(yǎng)基高，而且長(zhǎng)勢(shì)良好，萌芽發(fā)展速度快，也就是采用單一激素6-BA 而且質(zhì)量濃度是1.0mg/L 的環(huán)境中，孢子萌發(fā)狀況號(hào)，其中，6 號(hào)培養(yǎng)基中孢子萌發(fā)較4 號(hào)培養(yǎng)基更優(yōu)，部分孢子體經(jīng)過60d 的培養(yǎng)，僅有少部分的孢子會(huì)繼續(xù)成長(zhǎng)，但是并不能夠分化出原葉體。盡管處于同一培養(yǎng)基中，但是往往存在不同發(fā)育階段的孢子體。

2.2 孢子體誘導(dǎo)

向不同孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接直徑為1cm 的孢子體，經(jīng)20d 培養(yǎng)后，可以發(fā)現(xiàn)孢子出現(xiàn)諸多小突起，經(jīng)38d 培養(yǎng)后，可以發(fā)現(xiàn)蘑菇狀萌芽。

2.3 生根移栽

在無(wú)菌操作條件下，將誘導(dǎo)出的原葉體定期噴施無(wú)菌水和高溫消毒的液態(tài)培養(yǎng)基，經(jīng)70d 培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)原葉根基位置幼根較多，生根過程中，幼苗越長(zhǎng)越高且變粗，同時(shí)葉片數(shù)量越來(lái)越多，顏色也發(fā)生改變，最終呈完整且健壯的植株。在原葉體生長(zhǎng)至大約3cm 高度時(shí)，可向培養(yǎng)室外移煉苗，并逐步馴化，一直到可以進(jìn)行野外栽培。

3 討論

（1）荷葉鐵線蕨孢子的無(wú)菌萌發(fā)。本實(shí)驗(yàn)中，各個(gè)培養(yǎng)基中的荷葉鐵線蕨的孢子萌發(fā)率超過90%，僅有少部分孢子可能由于培養(yǎng)基失水導(dǎo)致其無(wú)法吸水進(jìn)行造成，均可以萌發(fā)。本研究中，采用由溫室中培養(yǎng)的荷葉鐵線蕨的孢子，均已經(jīng)發(fā)育成熟但是并沒有裂開，可見有性生殖類型均正常，所有具有較高的萌發(fā)率。

無(wú)菌播種實(shí)驗(yàn)中，pH 培養(yǎng)基包括2 種，也就是5.8 與7.0，通常采用pH 為5.8 的植物組織培養(yǎng)基，因?yàn)閜H 為7.0 的培養(yǎng)基對(duì)于植物的生長(zhǎng)不利。但是經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，荷葉鐵線蕨在pH 為5.8與pH 為7.0 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，萌發(fā)狀況無(wú)明顯差異，與此同時(shí)，萌發(fā)后具有顯著的孢子體生長(zhǎng)狀況，未來(lái)孢子體根誘導(dǎo)和體誘導(dǎo)期間，生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異。在pH 為7.0 時(shí)，培養(yǎng)基具有良好的硬度，且液化難度較大，可以很好的支撐苗，所以可以考慮應(yīng)用于荷葉鐵線蕨培養(yǎng)體系中，將pH 為7.0 應(yīng)用其中。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處于質(zhì)量濃度是1.0mg/L 和單一激素6-BA 培養(yǎng)基中的荷葉鐵線蕨的孢子具有良好的萌發(fā)效果。

（2）不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)荷葉鐵線蕨孢子增殖與生根誘導(dǎo)的影響。以前人的研究為依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)主要采用了2 種植物激素，分別是NAA 和6-BA。結(jié)果顯示，荷葉鐵線蕨孢子體誘導(dǎo)影響因素有很多，其中以不同濃度的6-BA 為主，而NAA 無(wú)顯著影響。在6-BA 質(zhì)量濃度是1.0mg/L 時(shí)，具有較高的誘導(dǎo)率，在pH 為7.0時(shí)，培養(yǎng)基具有良好的硬度，不容易液化，可以很好的支撐苗。所以，荷葉鐵線蕨孢子培養(yǎng)過程中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)pH 為7.0 培養(yǎng)基培養(yǎng)的重視。相似誘導(dǎo)生根階段，大部分采取NAA，以往實(shí)驗(yàn)中，主要通過NAA 對(duì)誘導(dǎo)生根并培養(yǎng)，但是不同于其他報(bào)道研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)主要通過無(wú)菌基質(zhì)誘導(dǎo)生根，生根效果不佳。其可能與蕨類植物自身發(fā)育特點(diǎn)存在緊密聯(lián)系，此外，實(shí)驗(yàn)階段溫度程度也是主要影響因素，為獲取顯著移栽效果，需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

（3）活性炭影響著荷葉鐵線蕨組織培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)過程中，主要采取活性炭，添加活性炭可抑制或者加快離體生長(zhǎng)速度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加活性炭可加快孢子生長(zhǎng)速度和萌發(fā)速度，所以原葉體誘導(dǎo)過程中，添加活性炭會(huì)對(duì)生根抑制，原因如下：由于活性炭將質(zhì)基由荷葉鐵線蕨生長(zhǎng)代謝形成的有害物質(zhì)吸出，對(duì)于孢子的萌發(fā)有利，而且可以加快孢子體生長(zhǎng)速度，但是因?yàn)榛钚蕴靠梢詫⒉糠譅I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸出，所以生根培養(yǎng)過程中可利用高溫方式滅菌基質(zhì)，但是具有較低的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度。生根的苗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求量多，但是因?yàn)榛钚蕴繉⒉糠譅I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸出，導(dǎo)致其無(wú)法保證植物所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以進(jìn)一步抑制了生根。