響應面法優化鎖陽水提取物提取工藝

王 玉 梅 喬 紅 艷 王 勤* 宋 玉 霞

（1.河西學院，甘肅 張掖 734000；2.蘭州祥靈醫藥有限公司，甘肅 蘭州 730100）

鎖陽是鎖陽科（Cynomoriaceae）植物鎖陽Cynomorium songaricum Rupr.的干燥肉質莖，俗稱“不老藥”，又名鐵棒槌、銹鐵棒、地毛球、羊鎖不拉、烏蘭高腰（蒙語），生長于土地缺乏有機質而富含鹽分的干燥多沙地帶，多寄生于蒺藜科Zygophyllaceae 白刺屬Nityaria L.植物根部，為全寄生種子植物［1-2］，是河西走廊的道地藥材之一［3-5］.具有補腎陽、益精血、潤腸通便的作用，臨床上主要用于腰膝痿軟、陽痿精滑、腸燥便秘等癥［6］.鎖陽含有多種化學成分，如三萜類、甾體類、黃酮類、有機酸類及鞣質等［7-9］.沒食子酸和原兒茶酸屬于有機酸類，其中沒食子酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的作用；原兒茶酸具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量的作用［10-12］.水煎煮法是中藥傳統的煎煮方法，近年來已有學者對鎖陽中某類化學成分的提取工藝進行了研究，對于鎖陽水提取物的研究也多是對其藥效的評價，尚未見對其提取工藝的研究，故本試驗以鎖陽水提取物中沒食子酸和原兒茶酸含量為響應值，運用響應面法優化鎖陽水提取物提取工藝［13-16］，以期為鎖陽的資源開發利用提供參考.

1 儀器與試劑

1.1 材料與試劑

鎖陽，采自甘肅張掖臨澤縣，并經河西學院醫學院王勤教授鑒定；對照品沒食子酸（按含量90.1%計，批號110831-200803）、原兒茶酸（按含量97.9%計，批號110809-200102）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸為色譜純；水為怡寶純凈水.

1.2 儀器與設備

LC-20A 高效液相色譜儀，日本島津公司，配置包括SPD-20AV 檢測器、SIL-20AC 自動進樣器、LC-20AD四元梯度泵、COT-20AC柱溫箱及色譜工作站；KQ-500E型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平FA2004，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HK-10B型500g搖擺式粉碎機，廣州市旭朗機械設備有限公司；PT-124/85S 電子天平，福州華志科學儀器有限公司；202-0 型電熱恒溫干燥箱，上海浦東榮豐科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，金壇市東城新銳儀器廠.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

圖1 對照品色譜峰

圖2 鎖陽樣品色譜峰

表1 流動相梯度洗脫條件

色譜柱：Hypersil ODS C18柱（250mm×4.6mm，2.5μm），流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，檢測波長：260nm，進樣量：10μL.沒食子酸、原兒茶酸對照品和樣品溶液HPLC色譜峰見圖1、圖2.

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品6.27mg，于5mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10min，作為沒食子酸對照品貯備溶液；精密稱取原兒茶酸對照品5.47mg，于5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10min，作為原兒茶酸對照品貯備溶液；分別精密量取沒食子酸對照品貯備溶液3mL和原兒茶酸對照品貯備溶液1mL，于50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10min，制成每1mL分別含沒食子酸75.24μg，原兒茶酸23.48μg的混合對照品溶液.4℃貯藏，備用.

2.3 供試品溶液的制備

取鎖陽粉末約1.0g，（過二號篩），精密稱定，置100mL 錐形瓶中，精密加入水30mL，回流提取2次，每次60min，合并提取液.精密量取上述水提液20mL，水浴濃縮至約5mL，轉移至5mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜過濾，即得.

2.4 標準曲線的繪制

分別精密吸取2.2項下制備的混合對照品溶液2，6，10，14，18μL進樣.按2.1項下色譜條件進樣測定，分別以沒食子酸、原兒茶酸色譜峰峰面積（A）對進樣量（X/μg）進行線性回歸，繪制標準曲線.得到沒食子酸回歸方程：y=2826954.74x-6745.35，R2=0.9999，進樣量為2-18μL 時線性范圍為0.15-1.35 μg；原兒茶酸回歸方程：y=3392985.52x+1790.60，R2=0.9999，進樣量為2-18μL 時線性范圍為0.04-0.42μg.

2.5 單因素試驗及結果

2.5.1 提取時間對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響

固定液料比30∶1（mL/g）、提取次數2次，考察提取時間為30min、45min、60min、90min對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響，結果見圖3.試驗數據表明，沒食子酸，原兒茶酸含量隨著提取時間的增加而增加，當提取時間為45min時，含量達到最大值，繼續增加提取時間，含量變化不大，從節約能源、縮短生產周期等方面綜合考慮，選定提取時間45min為最優提取時間.

圖3 提取時間對鎖陽水提物中沒食子酸和原兒茶酸提取效果的影響

2.5.2 提取次數對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響

固定液料比30：1（mL/g）、提取時間45min，考察提取次數為1次、2次、3次對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響，結果見圖4.試驗數據表明，沒食子酸，原兒茶酸含量隨著提取次數的增加而增加，當提取次數為2次時，含量達到最大值，繼續增加提取次數，含量變化不大，從節約能源、縮短生產周期等方面綜合考慮，選定提取次數2次作為最優提取次數.

圖4 提取次數對鎖陽水提物中沒食子酸和原兒茶酸提取效果的影響

2.5.3 液料比對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響

固定提取時間45min、提取次數2次，考察液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響，結果見圖5.試驗數據表明，沒食子酸，原兒茶酸含量在液料比30：1時達到最大值，隨著液料比的增加含量開始降低，可能是可溶性物質溶出太多，造成雜質含量增加.綜合考慮提取液總量與提取效率等方面的因素，選定30∶1作為最優液料比.

圖5 液料比對鎖陽水提物中沒食子酸和原兒茶酸提取效果的影響

2.6 響應面試驗及結果

2.6.1 響應面分析因素與水平的選取

在單因素試驗的基礎上，選取提取時間、提取次數、液料比3個主要因素，運用Box-Behnken的中心組合試驗設計原理進行試驗，并利用響應面法對鎖陽水提取物提取工藝進行優化，采用Design-Ex?pert10.0.1統計軟件進行試驗設計與回歸分析.試驗因素和水平見表2.

2.6.2 響應面分析試驗設計方案

根據Box-Behnken 的組合設計原理，采用Design-Expert10.0.1 軟件設計3 因素3 水平共15 個試驗，其中中心點重復5次試驗，試驗設計與結果見表3.

表2 響應面試驗因素與水平

表3 響應面分析方案及結果

2.6.3 響應面回歸模型的建立與分析

采用Design-Expert10.0.1 軟件對表3 中的數據進行二次多項式回歸擬合并對響應面進行方差分析.對沒食子酸，分析結果見表4，回歸模型P小于0.01，說明模型極顯著.回歸方程為沒食子酸含量（P1）=0.98+0.024A+0.089B+0.029C-8.250×10-3AB-0.039AC+0.076BC-0.15A2-0.26B2-0.15C2，相關系數R2=0.9100，回歸方程顯著.對原兒茶酸，分析結果見表5，回歸模型P小于0.01，說明模型極顯著.回歸方程為原兒茶酸含量（P2）=0.18+3.125×10-3A+0.035B+5.750×10-3C+8.250×10-3AB-0.015AC+0.014BC-0.019A2-0.057B2-0.031C2，相關系數R2=0.9010，回歸方程顯著.由分析結果可知，回歸方程可較好地描述各因素與沒食子酸、原兒茶酸含量之間的真實關系，可利用該回歸方程確定3個參數的最佳水平.

表4 響應面方差分析-沒食子酸

表5 響應面方差分析-原兒茶酸

2.6.4 響應面圖分析

響應面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應值的影響.鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取響應面3D圖譜及等高線見圖6至圖11.由響應面圖判斷，響應面的開口向下，且隨著各因素的增大，響應值也增大，當響應值增大到最大值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小.等高線圖同一曲線上沒食子酸、原兒茶酸得率相同，圖形中心得率最高.兩因素之間交互作用可以直觀地通過中心區域的等值線圓形程度和位置來判斷，等高線圓形形狀越扁，且越偏離中心位置交互作用越大，對沒食子酸、原兒茶酸得率的影響越顯著.

圖6 提取時間和提取次數對沒食子酸含量影響的響應面立體圖和等高線圖

圖6、圖7 分別是提取時間和提取次數對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量影響的響應面圖.保持提取次數為一定值時，沒食子酸、原兒茶酸含量隨著提取時間的增加而升高，達到峰值以后又逐漸降低；保持提取時間為一定值時，隨著提取次數的增加，沒食子酸、原兒茶酸含量也是先升高后降低.等高線圖呈扁圓形，表明提取時間和提取次數兩個因素間具有較強的交互作用.

圖8、圖9 分別是提取次數和液料比對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量影響的響應面圖.保持提取次數為一定值時，沒食子酸、原兒茶酸含量隨著液料比的增加而升高，達到峰值以后又快速降低；保持液料比為一定值時，隨著提取次數的增加，沒食子酸、原兒茶酸含量也是先升高后降低.等高線圖呈扁圓形，表明提取次數和液料比兩個因素間具有較強的交互作用.

圖7 提取時間和提取次數對原兒茶酸含量影響的響應面立體圖和等高線圖

圖8 提取次數和液料比對沒食子酸含量影響的響應面立體圖和等高線圖

圖9 提取次數和液料比對原兒茶酸含量影響的響應面立體圖和等高線圖

圖10、圖11 分別是提取時間和液料比對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量影響的響應面圖.隨著提取時間和料液比的增加，沒食子酸、原兒茶酸含量也是先升高到最大值，隨后又下降，表明提取時間和液料比對沒食子酸和原兒茶酸含量的影響也是比較大的.但是等高線圖略呈扁圓形，表明提取時間和液料比兩個因素間的交互作用較弱.

圖10 提取時間和液料比對沒食子酸含量影響的響應面立體圖和等高線圖

圖11 提取時間和液料比對原兒茶酸含量影響的響應面立體圖和等高線圖

通過對回歸方程微分求解，所得的鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取最優工藝參數為：提取時間45.86min、液料比31.35mL/g、提取次數2.19次，此條件下，沒食子酸和原兒茶酸提取量的預測值分別為0.992mg/g、0.189mg/g.由表4和表5還可以看出，影響鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量的各因素按照影響大小排序依次為提取次數＞液料比＞提取時間，其中提取次數的影響最大.

2.7 驗證性試驗

為了檢測試驗結果與真實情況是否相一致，根據優化結果進行了驗證性試驗，考慮到實際操作的可行性，將工藝條件修改為：提取時間45min、液料比30∶1（mL/g）、提取次數2次.在此條件下進行5次平行試驗，得到沒食子酸平均含量0.986mg/g，與預測得率的相對誤差為0.61%；原兒茶酸平均含量0.185mg/g，與預測得率的相對誤差為2.70%.證明模型理論預測值與實際值擬合效果良好，優化結果可靠.

3 結論

響應面法是集統計學、計算機科學和數學建模于一身的統計和優化方法，其具有較高的試驗精確度、并能明顯減少試驗次數，且建立的數學模型預測性較好，能夠反映各因素與響應值之間的關系［13］.響應面法雖然廣泛用于中藥提取工藝的優化，但關于鎖陽水提取物提取工藝的優化鮮見報道.本研究采用水回流提取法，以鎖陽水提取物中沒食子酸和原兒茶酸含量為響應值，通過響應面法優化鎖陽水提取物提取工藝.單因素試驗結果表明，提取時間、提取次數、液料比對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量的影響作用都比較明顯.在單因素試驗的基礎上，建立了3 因素3 水平的Box-Behnken 響應面分析方法，對鎖陽水提取物提取工藝進行優化以及驗證.結果表明，各因素對鎖陽水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量的影響大小順序為：提取次數＞液料比＞提取時間.優化的提取工藝條件為：液料比30∶1（mL/g）、提取時間45 min、提取次數2 次. 沒食子酸含量實測值0.986mg/g，與預測值的相對誤差為0.61%；原兒茶酸含量實測值0.185mg/g，與預測值的相對誤差為2.70%.因此，本試驗建立的二次多項回歸方程模型能夠較好地預測各因素與響應值之間的關系，能夠為鎖陽的進一步開發利用提供一定的理論基礎.