不同分子質量牛骨膠原多肽制備復合膜特性研究

姚玉梅 袁湘汝 韓魯佳 楊增玲 劉 賢

(中國農業大學工學院， 北京 100083)

0 引言

目前，資源短缺和白色污染問題日益加劇[1]，基于天然高分子原料開發生物基復合材料已成為高分子科學和材料科學的前沿領域之一。作為農產品加工業副產品的高附加值產品，基于動物骨資源酶解制備的膠原多肽(Collagen polypeptide, CP)因其優異的無毒性、低刺激性、熱塑性、可降解性和獨特的生物功能活性[2]，而成為一種具有廣泛應用前景、環境友好型可再生高分子材料[3]。膠原多肽材料具有良好的生物相容性和可調控的降解性，在復合膜[4]、粘結劑[5]、表面活性劑[6]和生物醫用材料[7]等領域具有廣闊的應用前景，是開發綠色可再生資源的有效策略[8]。但是，單一膠原多肽材料脆性大、硬度高、親水性強、力學性能差，不能滿足實際應用的條件[9]。羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose, CMC)是纖維素最重要的衍生物之一，具有良好的保水性、分散穩定性和成膜性[10]，能夠通過改性引入新的基團或化合物來增添一些新的性能[11]，常作為生物質基質和生物制品載體使用。

復合材料的綜合性能受所用原材料的自身性能與改性作用的影響顯著[12]。有研究者考察了膠原多肽與羧甲基纖維素共混對復合膜性能的影響，結果表明，與單一膠原多肽的材料性能相比，經羧甲基纖維素改性后制備的復合材料具有更為優異的理化性能，其熱穩定性、機械強度、疏水性和延展性均明顯提高[13-14]，并可兼顧抗氧化性、抗菌性、止血性等其他特性[11, 15]。此外，膠原多肽的濃度、顆粒尺寸、分子質量及生物功能活性也會影響復合材料的綜合性能[16]。然而，膠原多肽作為膠原蛋白的水解產物，在實際生產中常因水解度低、水解不徹底等原因[17]，而導致其分子質量較大、分布較寬，使得材料性能不易控制。目前，膠原多肽的分子質量對復合膜材料性能影響的相關研究較少，且未見對其影響機理的探討。

力學性能與疏水性是反映復合膜綜合利用價值的評價指標，生物相容性是評估材料穩定性與可靠性的必要條件，兩者都將決定材料最終能否應用于實際。為探討膠原多肽的分子質量對膠原多肽-羧甲基纖維素(CP-CMC)復合膜力學性能的影響，本文以溶液流延法制備4種不同膠原多肽分子質量的CP-CMC復合膜，并分別測定復合膜的力學性能、理化性質和結構性能，探討分子質量對復合材料的影響機理，以期為后續動物骨資源的高值化轉化利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

實驗材料：牛骨膠原多肽1(CP1)由賽森化工產品有限公司提供，平均分子質量為700 u；牛骨膠原多肽2(CP2)由北京凱泰新世紀生物技術有限公司提供，平均分子質量為1 000 u；牛骨膠原多肽3(CP3)由北京盛美諾生物技術有限公司提供，平均分子質量為3 000 u；牛骨明膠4(CP4)由賽森化工產品有限公司提供，平均分子質量為20 000 u。羧甲基纖維素(99%，分析純，山東西亞化工科技有限公司)，甘油(99%，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

實驗設備：RW20數顯型電動攪拌器(德國IKA公司)；SevenEasy實驗室pH計、XS105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；PHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；Se-KTQ-150A型可調制膜器(沈陽科晶自動化設備有限公司)；TCYQ型水浴恒溫振蕩器(蘇州市培英實驗設備有限公司)；3367型雙立柱臺式電子萬能材料試驗機(美國Instron公司)；OCA21型接觸角測量儀(德國Dataphysics公司)；SU3500型掃描電子顯微鏡(天美有限公司)；Spectrum400型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)；D8 Advance 型X射線衍射儀(德國Bruker公司)；SDT Q 600型熱重分析儀(美國TA公司)。

1.2 CP-CMC復合膜的制備

CP-CMC復合膜的制備流程是對溶液流延法[18]加以改進。首先，將羧甲基纖維素溶解于蒸餾水中，在室溫(20℃)下用攪拌器快速(600 r/min)攪拌至完全溶解，配置成質量分數為8%的CMC水溶液(溶液A)；其次，將不同分子質量的牛骨膠原多肽/明膠溶解于蒸餾水中，用2.0 mol/L的NaOH溶液將其pH值調節至10.0，在80℃下將其連續攪拌1 h制備8%的水溶液(溶液B1、B2、B3、B4)；再次，將溶液A和B按1∶1的質量比混合，以甘油作為增塑劑，添加量為成膜液的3%，充分攪拌混合溶液使其糊化成為均勻的成膜液；最后，在0.09 MPa真空度下脫氣20 min后，稱取相同質量的成膜液在聚四氟乙烯板上流延，并使用可調制膜器調節復合膜的初始厚度，然后將聚四氟乙烯板在干燥箱中50℃條件下干燥6 h拿出，于室溫下放置24 h，將干燥的薄膜完整地剝離，編號為M1、M2、M3、M4(對應溶液B1、B2、B3、B4)。在不添加膠原多肽類物質條件下，以相同制備工藝制備單一CMC薄膜樣品作為對照組樣品M0。

1.3 CP-CMC復合膜理化性質

1.3.1力學性能測試

將5種膜樣品分別切割成寬25 mm、長80 mm的長條，于測試前分別在溫度23℃、相對濕度(50±3)%下的恒溫恒濕箱中調節2 d，并使用靈敏度為1 μm的千分尺測量膜樣品的厚度d。利用標準方法使用ASTM D882-02型電子萬能材料試驗機測試膜樣品拉伸強度，略有改動[19]。將膜樣品兩端固定于夾具上，夾持距離為45 mm，拉伸速率為5 mm/min，通過計算機軟件從拉伸應力-應變圖自動計算楊氏模量，每種類型的膜樣品重復測量8次。拉伸強度計算公式為

(1)

式中LP——膜拉伸過程中的峰值強度，N

A——膜樣品的斷面面積，m2

在靜態模式下測量膜樣品的斷裂強度[19]，每種類型的膜樣品重復測量8次。斷裂伸長率計算公式為

(2)

式中 ΔL——斷裂時的長度增量，mm

L——試樣原長，mm

1.3.2水溶性測定

參照文獻[20]的方法測定膜樣品的水溶性，略有改動。將膜樣品切割成50 mm×50 mm的矩形片，并在60℃和0.01 MPa下干燥24 h后稱量，作為樣品的初始干質量W0。將每個膜樣品浸入250 mL燒杯中的200 mL蒸餾水中，并放至(25±0.1)℃的水浴振蕩器中振蕩一段時間。6 h后將膜樣品拿出，并于60℃和0.01 MPa下干燥24 h以確定最終干質量W1。由初始和最終干質量計算膜樣品的水溶性指數S，公式為

(3)

1.3.3表面親水性評價

為探究分子質量對膜樣品疏水性的影響，采用接觸角測量儀測定膜樣品與水的靜態接觸角[18, 21]。其中，膜樣品尺寸為2.0 cm×2.0 cm，在表面滴加2 μL蒸餾水，靜止一段時間后拍照，觀察其浸潤情況。

1.4 CP-CMC復合膜表征分析

1.4.1微觀結構(SEM)

采用掃描電子顯微鏡對膜樣品的表面形態進行表征。測試條件：膜樣品脫水后用離子濺射儀對其表面噴金制樣，儀器的加速電壓為15 kV，工作距離10 cm。

1.4.2傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)

采用傅里葉變換紅外光譜儀對5種成膜粉末樣品及其膜樣品進行官能團特征分析，參照文獻[22]略有改動。本實驗采用KBr壓片法，即將光譜級KBr和待測樣品分別經瑪瑙研缽充分研磨后，以1∶100質量比混勻。稱取150 mg混合試樣在壓片機壓制壓力40 MPa下保壓1.5 min，制成透明薄片。檢測時，紅外分析掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數為32次，分辨率為4 cm-1。

1.4.3X射線衍射(XRD)

采用X射線衍射儀分析膜樣品的結晶度差異性。一般情況下，結晶度越高，熔點越高，韌性越差，透光性越差。具體參數設置如下[18]：在CuKα射線下，X光管電壓40 kV，管電流40 mA，5°～60°范圍內，步長為0.02°，掃描頻率為2(°)/min，測定X射線衍射圖譜，并利用軟件MDI-Jade 5.0進行數據分析。

1.5 熱穩定性實驗

采用熱重分析儀對5種成膜粉末樣品及其膜樣品進行熱解特性實驗，參照文獻[23]略有改動。為保證樣品均勻性，將待測樣品經瑪瑙研缽充分研磨。稱取5～6 mg研磨樣品于坩堝中，隨后開始實驗。使用條件及相關參數為：以氮氣為載氣，流速為100 mL/min；以10℃/min的升溫速率升溫到700℃。

1.6 數據處理

采用Origin 8.5制圖。數據均采用SPSS V20.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD檢驗對數據進行顯著性差異分析，在95%置信區間認為具有統計學意義(p<0.05)。

2 結果與討論

2.1 CP-CMC復合膜的力學性能

表1 列出了4種復合膜的力學性能數據。由表可知，對比對照組M0，CP的添加顯著改變復合膜的綜合機械性能，即除M4外，復合膜具有更高的拉伸強度、斷裂強度和楊氏模量。進一步分析可知，隨著CP分子質量的增加，復合膜的拉伸強度和楊氏模量呈顯著降低趨勢，斷裂強度呈先降低后增加再降低的趨勢，在分子質量為700 u時為最大值；而隨著CP分子質量的增加，膜樣品的斷裂伸長率增加，當分子質量大于3 ku時，膜的斷裂伸長率開始下降。分析M1～M4膜樣品的力學性能數據與CP分子質量的關系可知，在分子質量為700 u時，復合膜的力學性能最佳，拉伸強度、斷裂強度和楊氏模量分別較對照組提升2.39、2.55、10.11倍，斷裂伸長率較對照組降低40%，隨后在分子質量為1 000 u時，復合膜力學性能較好。這可能是由于較小的分子質量可以軟化膜的剛性，增加膜的柔韌性，提高膜的拉伸強度、斷裂強度和楊氏模量[24-25]；分子質量較高的CP與CMC的相容性較差，影響膜樣品的力學性能[18]。

表1 CP分子質量對CP-CMC復合膜力學性能的影響Tab.1 Effects of molecular weight distribution of CP on mechanical properties of CP-CMC composite films

注：同列不同小寫字母表示組間差異顯著(p<0.05)。

2.2 CP-CMC復合膜的結構性能

2.2.1相容性

在圖1 (2θ表示角度變化)可以看到，M0在2θ=20°時出現強衍射峰，是羧甲基纖維素的特征衍射峰[26]。由M1～M4的XRD譜圖變化可知，隨著CP分子質量的增加，衍射峰寬度逐漸變寬，強度逐漸減弱，并且衍射峰的位置發生移動，表明復合膜的結晶能力逐漸減弱。這主要是由于復合膜中各組分之間存在強烈的作用，反應所形成的交聯網絡結構限制了羧甲基纖維素分子鏈的活動性，破壞了其原有的晶體結構[27]。

圖1 5種膜樣品的XRD譜圖Fig.1 XRD spectra of five kinds of film samples

圖2是粉末原料與復合膜樣品的熱重分析結果。如圖2a、2b所示，所有成膜原料在升溫開始階段50～150℃范圍有一個很小的失重峰，這明顯是樣品中水分的蒸發過程；150～350℃范圍樣品的失重速率明顯提高，并達到峰值。其中，CMC在280℃發生明顯失重，失重率為21.33%，這是由于羧甲基纖維素開始降解，—COO—氧化釋放出CO2，從而質量迅速下降[18]。不同分子質量CP的失重曲線相差不大，均在290℃發生明顯失重，其中CP1的失重率最高，為29.04%。由圖2c、2d可知，對比單一CMC薄膜樣品的TGA曲線，添加不同分子質量的CP后，復合膜樣品失重范圍大致類似，膜樣品的失重率降低，且最大的降解溫度向右偏移。其中，CP2對降低復合膜的最終失重率和提高最大失重速率的峰溫具有明顯作用。以上數據說明，復合膜的熱穩定性有了較大的提升，這是由于CP與CMC的相容作用改善了膜樣品的結構，造成了熱解溫度的變化。由圖2還可以看出，相對于其它復合膜樣品而言，M0膜樣品前期水分的蒸發失重多，說明單一CMC薄膜樣品具有較強的吸水性。

圖2 5種成膜原料及其膜樣品熱解特性的熱重分析Fig.2 Pyrolysis characteristics of five kinds of film forming materials and their film samples using thermogravimetric analysis

2.2.2傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)

圖3 5種成膜原料及其膜樣品的FT-IR圖Fig.3 FT-IR spectroscopy of five kinds of film forming materials and their film samples

2.2.3微觀結構(SEM)

圖4 5種膜樣品的掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of five kinds of film samples

圖4是單一CMC薄膜樣品與4種CP-CMC復合膜樣品的表面微觀結構圖。在500倍掃描電鏡下，圖4a 顯示單一CMC薄膜樣品表面存在少許溝槽、褶皺，圓形或橢圓形CMC疏松堆積排列(圖4b)，這樣的材料結構單一且不穩定，嚴重影響薄膜的力學性能與疏水性；圖4c～4f分別顯示添加了不用分子質量CP制備的復合膜表面明顯變得光滑、致密和連續，說明CP與CMC在溶液中具有較好的相容性，對膜結構的影響較大。結合5種膜樣品的力學性能、相容性和FT-IR等結果，說明CMC與CP的結合將會改變膜樣品的表面微觀形態，提高復合膜的相關機械強度，改善結晶度，并使得結構更加均勻，尺寸穩定性增加[24]。隨著添加CP分子質量的增加，復合膜樣品的表面越來越粗糙(圖4c～4f)，這是因為較高分子質量的CP為固體結晶狀，易導致成膜后少量析出[18]。此外，明膠-羧甲基纖維素復合膜樣品的微觀結構中存在較多氣泡(圖4f)，這是由于明膠的分子質量較大，仍保存部分蛋白質的特性，具有優異的起泡性和泡沫穩定性。

2.3 CP-CMC復合膜的疏水性

圖5 5種膜樣品的靜滴接觸角Fig.5 Contact angle determination of five kinds of film samples

水溶性和表面親水性通常由分子結構決定，包括結晶度和交聯，是膜樣品熱穩定性、微觀形態和疏水性的反映。一般來說，水溶性越小，表觀接觸角越大，表面越疏水[21, 31]。對照組樣品的水溶性指數為63.55%，而復合膜M1～M4的水溶性指數分別為41.00%、34.91%、41.32%、40.16%。CP的添加使得復合膜樣品的水溶性顯著降低，且復合膜的水溶性隨CP分子質量的增加呈先降低后增加趨勢，且M2膜的水溶性最低。結合SEM 的結果分析可知：隨著復合膜樣品結構密度的增加，疏水性逐漸增加。由圖5可知，對照組樣品的接觸角為33.94°，而復合膜M1～M4的接觸角分別為45.77°、50.06°、30.93°、82.91°；隨著CP分子質量的增加，接觸角呈先增大后減小再增大的趨勢，這說明CMC與CP共混在一定程度上可以提升膜樣品表面的疏水性。相較于對照組，在CP分子質量為1 000 u時，復合膜的水溶性指數降低了28.64個百分點，即降低了45%，接觸角提高了16.12°，充分表明低分子質量的CP有利于改善復合膜樣品的疏水性。這是由于CP分子質量的變化會引起其表面疏水性、溶解度等性能的變化[32]。此外，復合膜M4的接觸角最好，且吸水溶脹程度大，這是由于明膠保留了蛋白質的部分特性，使得復合膜樣品表面具有一定的疏水性，可作為一種發泡劑應用。

3 結束語

以4種不同分子質量的膠原多肽為研究對象，制備了4種復合膜樣品，并對獲得的膜樣品進行了微結構與性能分析。研究發現，添加膠原多肽/明膠可以明顯改善膜樣品的力學性能、疏水性、相容性和表面微觀結構。在膠原多肽分子質量為700～1 000 u時，復合膜具有更高的拉伸強度和更低的斷裂伸長率，熱穩定性和疏水性最高，即最高降解溫度由280℃升至290℃；在分子質量為1 000 u時，水溶性指數降低45%，接觸角提高16.12°；隨著膠原多肽分子質量的增加，復合膜的力學性能降低，表面微觀結構粗糙，并出現較多氣泡，疏水性降低。研究結果表明，膠原多肽的分子質量對其復合膜材料具有顯著影響，且700～1 000 u為膠原多肽向復合膜材料轉化的最佳分子質量區間。