4 種常用水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性

程劍，羅鳴鐘，魏巍，李銳

（1.上饒幼兒師范高等專科學校，江西 上饒 334000；2.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025；3.浙江省農業科學院，省部共建農產品質量安全國家重點實驗室（籌），浙江 杭州 310021）

黑斑蛙Rana nigromaculata 是我國分布最廣的水產養殖兩棲動物之一，具有重要的經濟價值[1]。2018年，我國蛙類總產量已超過10 萬t，比2017年增長了11.57%，在全國水產養殖總產量中增長迅速[2]。黑斑蛙肌肉中粗蛋白含量高于中國林蛙R.Chensinensis、虎紋蛙R.tigrina、棘胸蛙R.spinosa等經濟蛙類，而脂肪含量僅為0.35%，鮮味氨基酸含量高于牛蛙R.catesbeina，具有高蛋白、低脂肪、味道鮮美的特點[3,4]。水域生態環境污染以及過度捕撈使黑斑蛙自然資源量急劇減少，1989年野生黑斑蛙已列為我國的二級野生保護動物。黑斑蛙的人工養殖業逐步發展起來，主要以稻田圍網、仿生態養殖為主，也有池塘精養、大棚養殖等模式。藥物和水產消毒劑如高錳酸鉀、硫酸錳等的濫用，嚴重影響了黑斑蛙養殖業的發展。

黑斑蛙為兩棲動物，皮膚具有滲透水分和交換氣體的能力，其繁殖活動和幼體（蝌蚪）發育均在水中進行，水域的污染直接影響其生長、生殖、發育、內分泌的調節和血液循環等。黑斑蛙蝌蚪階段細胞分裂旺盛，對環境的變化極為敏感，因此常用作水環境質量指示生物[1,5-7]。目前，利用黑斑蛙蝌蚪及胚胎評估化學品生態毒性，已有大量研究。急性毒性研究發現，常見重金屬離子對黑斑蛙蝌蚪的毒性大小依次為：Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Cr6+＞Pb2+[8]；養殖實驗也表明，隨著鎘離子濃度的升高，蝌蚪的體質量和長度的增長率降低，完全變態所需時間增長[9]。在農藥殺蟲劑方面，報道了氯氰菊酯[10]、三唑酮[11]、環丙唑醇[12]、甲胺磷[13]、三氯殺螨醇[14]和異噻唑啉酮類殺菌劑[15]等對黑斑蛙蝌蚪的急性和慢性毒性效應。有機化合物雙酚A[5]、壬基酚[6]、苯胺[7]、離子液體[C8mim]Br[16]等的毒性也做了研究。

消毒劑在水產養殖中發揮著重要作用，主要用于養殖水體清塘、苗種下塘前藥浴、疾病防治等，合理、科學使用消毒劑，能有效殺滅養殖環境中的病原微生物，防止疾病的發生。目前，關于硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀[17]、氯化鈉等常見消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性研究罕見報道。

通過了解常用水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的毒性效應，對于規范用藥，完善黑斑蛙生態繁養技術具有重要的實踐意義。本實驗采用半靜態水生生物急性毒性實驗法，研究生產中常用的硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀和氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性效應，得出半致死濃度、安全濃度以及藥物毒性蓄積程度系數，以期為黑斑蛙野生資源的保護以及人工繁育技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用蝌蚪體質量為（0.31±0.04）g，體長為（2.55±0.27）cm，由長江大學水產基地提供，暫養于實驗室塑料箱中，用曝氣的自來水，連續充氣，溫度為（20.0±1.5）℃，pH 為（7.25±0.25），溶氧≥6.0mg/L，光照周期12 h 光照∶12 h 黑暗。挑選外觀正常，體質健康，規格接近的個體用于實驗。

聚維酮碘購自山西華坤生物科技有限公司，有效成分10%；硫酸銅、高錳酸鉀和氯化鈉購自湖北康盛醫藥科技有限公司，分析純，有效成分99%。按4 種消毒劑的使用說明上的有效濃度用雙蒸水配置母液，實驗時由母液稀釋成試驗液。

1.2 方法

48h 的預實驗得出蝌蚪的最大無死亡質量濃度和全部致死濃度。依此設計了6 個等對數間距的實驗質量濃度梯度（表1）。每組設3 個平行組，1 個空白對照組，每組10 尾蝌蚪。

實驗期間不投餌，每隔24h 更換藥液1 次，實驗期間各組水質一致。實驗采用半靜態方式水生生物急性毒性實驗法[18]。實驗開始后12h 連續觀察蝌蚪的反應及運動情況并記錄，在24h、48h、72h、96h觀察蝌蚪的死亡數據并及時清出死亡個體。

表1 4 種水產消毒劑的實驗濃度Tab.1 The concentrations of four aquaculture disinfectants in the experiment

1.3 數據處理

采用寇式法（Karber）計算半致死濃度（LC50）、安全濃度（SC）和半致死濃度的95%置信區間（CI），并以實驗濃度的對數為橫坐標與死亡率為縱坐標做直線回歸方程[18]，利用藥物毒性蓄積程度系數（MAC）來分析蝌蚪體內對藥物蓄積和降解的變化，相關計算公式如下：

半致死濃度（LC50，mg/L）：LogLC50=Xm-d（∑p-0.5）；

安全濃度（SC，mg/L）：SC=48hLC50×0.3/（24hLC50/48hLC50）2；

半致死濃度95%置信區間（CI，mg/L）：95%CI=LogLC50±1.96×d［∑（pg/n）］0.5；

藥物毒性蓄積程度系數（MAC，%）：MAC=100%×（t1LC50-t2LC50）/（t0LC50-tmLC50）。

上式中：Xm為消毒劑最大濃度的對數，d 為相鄰濃度的對數差值，P 為死亡率（%），∑p 為各組死亡率之和，g 為存活率（%），n 為每組實驗蝌蚪的尾數；t1LC50和t2LC50為t1和t2時的半致死濃度值（mg/L），t0LC50和tmLC50分別為實驗初始和結束時半致死濃度（mg/L）。

2 結果與分析

2.1 中毒癥狀

實驗前6h，4 種水產消毒劑高濃度組（濃度Ⅴ和Ⅵ）的蝌蚪開始興奮，游動迅速、上下攪動水體、趨邊游動或沖撞塑料箱沿壁；高錳酸鉀組中蝌蚪反應較為強烈，劇烈游動，肛門有淺紅色絲狀粘稠物排出，體表出現粘液；中低濃度組（濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）的蝌蚪出現應激反應，如浮頭、靜止不動、呼吸不暢等癥狀，但過一段時間后逐漸恢復正常狀態，而氯化鈉組中蝌蚪分泌粘液最為明顯。6h 后高濃度組的蝌蚪身體逐漸地失去平衡，漂浮于水面，呼吸逐漸減弱，身體扭曲，翻轉，游動緩慢，有部分側翻，最后沉底死亡。4 種消毒劑中死亡蝌蚪癥狀存在不同：硫酸銅組中毒死亡的蝌蚪腹部膨大，嘴部出現白色絮狀黏濁物，尾部僵硬彎曲，逐漸脫水，體積縮小，體色呈淡藍色；聚維酮碘組中毒死亡的大部分蝌蚪肛門有糞便排出；高錳酸鉀中死亡個體尾梢上翹，縮水變小，蝌蚪體色微呈淡紅色；而氯化鈉組中毒死亡的蝌蚪脫水嚴重，體型縮小明顯，尾部彎曲，泄殖孔排泄出白色的絮狀粘稠物，體表有大量粘液附著。

表2 4 種水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的致死率Tab.2 Mortalities of tadpoles of frog R.nigromaculata exposed to the four aquaculture disinfectants

2.2 急性致死效應

在96 h 的急性毒性實驗中，對照組的蝌蚪均未發生死亡，各消毒劑處理組蝌蚪的死亡率隨藥物濃度增加、實驗時間的延長而上升（表2）。

低濃度組（濃度Ⅰ和Ⅱ）的氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的急性致死效應最小，96 h 的死亡率不超過10%；高錳酸鉀的急性致死效應較小，96 h 的死亡率為36.67%；硫酸銅和聚維酮碘對黑斑蛙蝌蚪的急性致死效應較大，96 h 的死亡率均超過為50%。中高濃度組（濃度Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ）中，四種水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性致死效應較大，96 h 時各組均存在100%的死亡率。在最高濃度的實驗中，除24 h時的聚維酮碘，其余時間各組均100%死亡。

2.3 半致死濃度和毒性蓄積效應

硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀、氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的24h、48h、72h 和96h 的半致死濃度LC50、半致死濃度的95%置信區間CI、藥物毒性蓄積程度系數MAC 和安全濃度SC 見表3。由表3 可知：半致死濃度均隨實驗時間的延長而下降，硫酸銅對黑斑蛙蝌蚪24h、48h、72h 和96h 的半致死濃度分別為3.503 mg/L、3.061 mg/L、2.183 mg/L 和1.689mg/L，聚維酮碘為20.261 mg/L、15.489 mg/L、10.864 mg/L 和9.347mg/L，高錳酸鉀 為3.221 mg/L、2.109 mg/L、1.905 mg/L 和1.803mg/L，氯化鈉為8818.652 mg/L、8298.550 mg/L、7928.583 mg/L 和7348.559mg/L。安全濃度由低到高為：高錳酸鉀＞硫酸銅＞聚維酮碘＞氯化鈉。四種水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的藥物毒性蓄積程度系數（MAC）隨實驗時間延長而產生的變化存在差異。聚維酮碘和高錳酸鉀的MAC 值隨實驗時間的延長而下降，聚維酮碘下降較慢，而高錳酸鉀下降較快。硫酸銅和氯化鈉的MAC 值在96h 內變化相反，硫酸銅先升高后降低，氯化鈉先降低后升高。

根據藥物濃度對數和死亡率-概率單位的關系計算出4 種藥物24h、48h 和96h 的回歸方程（表4）。

表3 4 種水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性特征分析Tab.3 Analysis of acute toxicity of four aquaculture disinfectants to tadpoles of frog R.nigromaculata

表4 4 種水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的回歸方程Tab.4 Regression equations of four aquaculture disinfectants to tadpoles of frog R.nigromaculata

3 討論

3.1 4 種水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性特征

半致死濃度（LC50）是評價藥物對水產動物急性毒性的重要指標，根據國家環境保護總局發布的毒性分類標準[20]，急性毒性96hLC50＜0.1mg/L 為劇毒，0.1～1.0mg/L為高毒，1.0～10.0mg/L 為中毒，＞10.0mg/L為低毒。本實驗結果顯示：氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的96hLC50為7348.559mg/L 屬低毒藥物，硫酸銅、聚維酮碘和高錳酸鉀的96hLC50分別為1.689mg/L、9.347mg/L 和1.803mg/L，均屬中毒藥物。4 種水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的毒性由強至弱依次為：硫酸銅＞高錳酸鉀＞聚維酮碘＞氯化鈉。

在本試驗中，硫酸銅對黑斑蛙蝌蚪的96hLC50為1.689mg/L，換算為Cu2+對黑斑蛙蝌蚪的96hLC50為0.676 mg/L，高于澤陸蛙Fejervarya multistriata（0.118 mg/L）[22]、牛蛙（0.24 mg/L）[23]、中華蟾蜍Bufo gargarizans（0.3625 mg/L）[24]，而低于昆明裂腹魚Schizothorax grahami（2.275 mg/L）[25]、厚頜魴Megalobrama pellegrini（4.45 mg/L）[26]。黑斑蛙蝌蚪對硫酸銅的耐受性在無尾兩棲類蝌蚪中較高，與魚類幼苗比較，則耐受性較差。在本試驗中，聚維酮碘對黑斑蛙蝌蚪的96 h LC50為9.347 mg/L，低于葛氏鱸塘鱧Perccottus glehni（65.7 mg/L）[27]、暗紋東方鲀Takifugu obscurus （151.09 mg/L）[28]、大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus（388.47 mg/L）[29]。在本試驗中，高錳酸鉀對黑斑蛙蝌蚪的96hLC50為1.803 mg/L，低于昆明裂腹魚（2.267 mg/L）[25]、厚頜魴（5.28 mg/L）[26]，高于褐鱒Salmo trutta（0.75 mg/L）[30]，而與鱖Siniperca chuatsi（1.80 mg/L）[31]接近。在本試驗中，氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的96h LC50為7348.559 mg/L，即7.35 g/L，低于福壽螺Pomacea canaliculata（11.64 mg/L）[32]。

3.2 4 種水產消毒劑在黑斑蛙蝌蚪體內的蓄積與降減的特征分析

在研究生物對毒物的蓄積與降減動態時，常用MAC 即藥物毒性蓄積程度系數作為生物對毒物敏感程度差異的指示參數[19]。一般認為，MAC 為正值時，蓄積作用強于降減作用，MAC 為負值時，降減作用強于蓄積作用；MAC 值越大，即毒效蓄積幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大。

對4 種水產消毒劑的比較發現，MAC 最大和最小值均出現在高錳酸鉀實驗中，表明黑斑蛙蝌蚪對高錳酸鉀敏感性較強，其降解毒效能力也較強。在48～72h 實驗中，蝌蚪對聚維酮碘的MAC 值下降明顯，48～72h 的MAC 值是24～48h 的18.27%；在72～96h 實驗中，蝌蚪對聚維酮碘的MAC 值下降明顯，72～96 h 的MAC 值是48～72h 的32.82%，說明其降解毒效能力較強，毒效蓄積速度下降，聚維酮碘實驗尤為明顯。實驗在各時間段，黑斑蛙蝌蚪對硫酸銅和氯化鈉的蓄積幅度較為均衡，說明其毒效蓄積較強，降解毒效能力較差。因此，建議在探討藥物對生物的毒性效應時，應分析藥物毒性蓄積變化，充分考慮時效性才能更全面評估藥物的毒性效應。

3.3 4 種水產消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的用藥安全

水產消毒劑主要用于苗種、養殖水體和生產用具的消毒滅菌，定期使用消毒劑類藥物是預防出血、爛鰓等細菌性疾病以及寄生蟲病的有效方法。本實驗中，黑斑蛙蝌蚪對硫酸銅的安全濃度為0.701 mg/L，與全池潑灑的常用劑量為0.75 mg/L 相當，理論上可以使用硫酸銅作為黑斑蛙蝌蚪疾病治療的漁藥，但考慮到重金屬銅離子可在生物體內積累，因此在養殖生產實踐中應慎用。聚維酮碘的安全濃度為2.715 mg/L，在全池潑灑常用劑量2～4mg/L 范圍內，可以使用。高錳酸鉀的安全濃度為0.271 mg/L，遠低于生產上常用的潑灑濃度（1～2mg/L），不建議使用高錳酸鉀潑灑消毒。目前，生產上僅用氯化鈉下塘前浸泡消毒苗種，而少見用于水體潑灑。氯化鈉在水中溶解度高，造成水體鹽度變化，不僅作用于水產動物的滲透壓調節，還刺激或抑制其攝食、新陳代謝及激素傳導等[33]。不同淡水生物對鹽度的適應性不同，如弓斑東方鲀Fugu obscurus[34]、小鋸蓋魚Centropomus parallelus[35]和金魚Carassius auratus[36]在低鹽度時特定生長率和飼料轉化率較高，而花鰻鱺Anguilla marmorata 和太平洋雙色鰻鱺A.bicolor pacifica 在淡水中生長良好，在鹽度5、10 和18 水體中生長受抑制[37]。氯化鈉來源廣，價格便宜，研究低鹽度的潑灑消毒以及對水生動物生長的影響，具有重要的實踐意義。

基于本研究結果，建議在黑斑蛙蝌蚪消毒以及疾病防治中，使用聚維酮碘安全，硫酸銅需慎用，高錳酸鉀不宜使用，而氯化鈉可浸泡使用，潑灑使用尚需進一步研究。黑斑蛙蝌蚪對毒物反應敏感性高于一般魚類苗種，有良好的劑量與效應關系，用黑斑蛙蝌蚪輔助傳統的理化監測儀器監測水質，能在一定程度上反映出環境污染的綜合生物學效應。利用黑斑蛙蝌蚪作為模式生物，進行急性毒性試驗，對于規范我國水產藥物的毒性評價具有一定意義。