葛根素對(duì)富血小板纖維蛋白環(huán)境下MC3T3-E1成骨細(xì)胞生物學(xué)性能的影響

楊忠學(xué) 張?jiān)茲?張宇 喬魯卉 侯玉東

256600,濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科

富血小板纖維蛋白(PRF)制取[1]自自體血，無毒性、無免疫原性，富含高濃度的生長因子(PDGF、TGF、IL-4等)能夠有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化[2]。葛根素作為一種植物雌激素(異黃酮類衍生物)，近年來研究發(fā)現(xiàn)葛根素能夠抑制骨吸收防止骨質(zhì)疏松[3]和影響成骨細(xì)胞的增殖和分化[4]，在多名學(xué)者的研究[4-6]中發(fā)現(xiàn)單純葛根素對(duì)成骨細(xì)胞作用時(shí)，最佳濃度區(qū)間基本趨于10-8～10-6mol/L。但是其對(duì)骨結(jié)合的影響機(jī)制尚有爭議。本實(shí)驗(yàn)通過觀察葛根素在PRF環(huán)境培養(yǎng)下對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)性能的影響，探討葛根素與PRF可能的協(xié)同作用，為臨床骨增量手術(shù)提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 PRF的制備

采志愿者自體血，按文獻(xiàn)[7]方法制備PRF并以α-MEM 培養(yǎng)基浸泡保存。

1.2 CCK8比色法檢測細(xì)胞增殖

常規(guī)培養(yǎng)MC3T3-E1，重懸后以 3×104個(gè)/ml 接種于預(yù)先鋪展PRF的96 孔板，1、4、7 d 加入CCK-8混合液，測定A值。

1.3 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測

將細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)后，按ALP說明測定1、4、7 d A值。

1.4 RT-qPCR 檢測細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)

將細(xì)胞成骨誘導(dǎo)。7 d后提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄 cDNA。選擇20 μl 體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見表1)，隨后實(shí)時(shí)定量PCR測定相關(guān)基因。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.5 羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色

制作細(xì)胞爬片，鈣化誘導(dǎo)培育24 h。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架與PRF纖維束形態(tài)。

1.6 鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)，培養(yǎng)21 d，待無定形物質(zhì)形成后取出培養(yǎng)板，茜素紅染色，鏡下觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度葛根素對(duì)PRF環(huán)境細(xì)胞增殖的情況

CCK-8比色顯示：實(shí)驗(yàn)組干預(yù)能有效提高細(xì)胞增殖活動(dòng)(圖1)。

圖1 MC3T3-E1細(xì)胞增殖曲線

2.2 堿性磷酸酶(ALP)活性測定

ALP結(jié)果顯示：在葛根素(RPF)的影響下，細(xì)胞ALP相對(duì)活性增高(圖2)。

2.3 鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)21 d天后，以10-7mol/L 組鈣化小結(jié)密度最高(圖3)。

圖2 MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性(①:與1 d相比較,P<0.05；②:與4 d相比較,P<0.05；③:與1 d的PRF濃度10-6 mol/L組相比，P<0.05)

2.4 Runx2 mRNA的表達(dá)

在相同時(shí)間點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比對(duì)Runx2 mRNA的表達(dá)均有一定的促進(jìn)作用(圖4)。

2.5 細(xì)胞骨架形態(tài)與PRF纖維染色

圖3 各組MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)形成觀察(茜素紅染色，× 200)

圖4 各組MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2 mRNA的表達(dá)(①:與對(duì)照組相比,P<0.05；②:與PRF組相比,P<0.05；③:與PRF濃度為10-8 mol/L組相比，P<0.05)

如圖5所示，陰性對(duì)照組中MC3T3-E1細(xì)胞鋪展面積較小，細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維模糊。10-7mol/L葛根素(PRF)組中，細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞體積最大，細(xì)胞伸展范圍最廣，可以清晰的看到細(xì)胞骨架呈網(wǎng)格狀鋪展在PRF纖維束中(圖5)。

3 討 論

種植修復(fù)是目前牙列缺損及牙列缺失的最優(yōu)選擇，解決骨量不足的問題也變成了我們關(guān)注的重點(diǎn)[8]。PRF是一高效經(jīng)濟(jì)且安全的骨增量輔助方法。但就其臨床使用方面，單獨(dú)使用或與骨粉聯(lián)合使用最為常見[9]，與藥物混合使用的方案較少。而近年研究發(fā)現(xiàn)：葛根素具有一定的成骨作用。

葛根素作為一種植物雌激素(異黃酮類衍生物)，能夠抑制骨吸收防止骨質(zhì)疏松且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化。本研究表明在PRF環(huán)境下，不同濃度的葛根素在短期內(nèi)皆能促進(jìn)MC3T3-E1前成骨細(xì)胞的增殖，本實(shí)驗(yàn)中以10-7mol/L葛根素(PRF)組為最優(yōu)，但就PRF組與低濃度組(10-8mol/L)的增殖曲線變化趨勢(shì)，可能與PRF中生長因子的緩釋與藥物濃度過低有關(guān)，有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

圖5 各組MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞骨架形態(tài)(激光掃描共聚焦顯微鏡，× 400)

ALP作為成骨細(xì)胞外酶，其活性表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的一個(gè)顯著指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，在PRF環(huán)境下，各濃度的葛根素對(duì)ALP的表達(dá)均有一定的促進(jìn)作用，Zhan等[10]研究中不同濃度葛根素對(duì)MC3T3-E1的ALP表達(dá)的結(jié)果與本研究基本一致，且各濃度組均與陰性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并在茜素紅染色中均可看到在PRF環(huán)境下加入了不同濃度的葛根素后，礦化結(jié)節(jié)的增多，顯示出新骨生成能力增強(qiáng)[11]。

Runx2是成骨細(xì)胞早期分化過程中的重要基因，在本研究表明，在PRF環(huán)境下不同濃度的葛根素均可促進(jìn)Runx2的表達(dá)，且均與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在PRF與葛根素的共同作用下，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞早期分化與骨礦化。

成骨細(xì)胞中以肌動(dòng)蛋白為主要成分的細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞形態(tài)，以及在種植體表面依附和伸展具有重要意義[12]。本研究觀察到MC3T3-E1前成骨細(xì)胞在PRF纖維束中的附著。且隨葛根素濃度的變化，細(xì)胞的形態(tài)、體積、內(nèi)部架構(gòu)、依附程度都發(fā)生變化，以10-7mol/L葛根素(PRF)組最佳，細(xì)胞體積大、內(nèi)部架構(gòu)清晰、依附程度較好。

骨結(jié)合與骨增量是口腔種植修復(fù)中的重要環(huán)節(jié)，在PRF環(huán)境下葛根素可以有效促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化、伸展與粘附，提高成骨相關(guān)基因Runx2的表達(dá)水平。可以為臨床使用提供一種新的思路，在PRF環(huán)境下葛根素最佳濃度還有待進(jìn)一步研究。