納米白藜蘆醇脂質體的制備及分配系數測定

張茹，元琳琳，孫凱玥，王珊，耿麗娜,＊，張建軍

1河北師范大學化學與材料科學學院, 石家莊 050024

2河北師范大學分析測試中心, 石家莊 050024

1 引言

白藜蘆醇(3,4’,5-三羥基-1,2二苯乙烯)是一種天然存在的多酚和植物抗毒素，廣泛存在于葡萄、漿果、花生等植物中，具有抗炎、抗氧化、抗癌和神經保護等作用1,2。Mohamed等3綜述了白藜蘆醇在直腸癌和皮膚癌預防和治療中的作用。Jang等4報道了白藜蘆醇的抗白血病特性，并對其生物學和藥理活性進行了大量的研究5。然而，白藜蘆醇難以通過高選擇性的血腦屏障(blood brain barrier,BBB)，在中樞神經系統疾病中的生物效率不太理想，腦內生物利用度低6。

脂質體作為近幾年新出現的一種藥物載體，無毒、無免疫原，主要由磷脂雙層膜組成，具有類細胞結構，雙層膜中含有親水分子和親脂分子7，具有靶向性、低毒性、生物相容性和長效緩釋性等諸多優點8。研究發現，經脂質體包封，可改善藥物的理化性質，提高其穩定性和生物利用度9。Kristl等10研究發現白藜蘆醇脂質體能夠延緩藥物釋放，細胞吸收明顯增強，并能有效避免自由基的損傷。Ethemoglu等11研究發現脂質體包封可以改善癲癇大鼠腦內游離白藜蘆醇的作用，使白藜蘆醇的抗氧化和抗癲癇特性有所提高。王宏雁等12采用逆向蒸發法制備了白藜蘆醇納米脂質體，發現其抗氧化能力良好并且對DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)具有明顯的清除作用。王彥春等13發現，白藜蘆醇脂質體比其純藥溶劑對帕金森模型大鼠黑質細胞的保護作用更強。

一般來說，藥物從脂質體釋放取決于動力學因素，如藥物滲透性和熱力學參數。脂質體研究過程中，經常使用油-水(正辛醇-水)分配系數(Po/w)來預測藥物的包封率以及載藥量14。鄧英杰等15以正辛醇-水分配系數來模擬物質在體內水相和生物相的分配情況，預測藥物在體內的吸收情況。這種方法以研究藥物的親脂性為主16，反映藥物的疏水作用而忽略生物膜的生物學特性17。而脂質體-水分配系數(Plip/w)能模擬生物膜的結構18，預測藥物在生物膜中的的分配情況，反映在體內藥物與生物膜(磷脂雙分子層)間的作用情況，如疏水性、靜電力和氫鍵等藥物與生物膜之間的綜合作用19。因此，國內外學者在研究中也同樣使用脂質體-水分配系數來表征藥物在生物膜中的分配情況20。Chavez-Capilla等21利用脂質體-水分配系數判斷砷類化合物通過細胞膜的能力，更加精準地評估了三價砷和硫砷化物對人體的危害。Esteves等22將脂質體-水分配系數作為預測人體藥物吸收的生物模型。Ikonen等23建立了測定脂質體-水分配系數的電化學方法，可更加精準地測定樣品中磷的含量。油-水分配系數和脂質體-水分配系數不僅可單獨用于測定藥物在生物膜的分配情況，一些學者在研究中采用兩者結合的方法綜合了判斷了藥物于生物膜之間的作用情況。陸偉根等24測定了Po/w和Plip/w隨體系pH值的變化情況，發現兩者均隨體系pH的增加而增大，初步判斷草烏甲素與磷脂膜之間以疏水作用為主。鐘海軍等25通過對比燈盞花素Po/w和Plip/w隨體系pH的變化趨勢，發現兩者正好相反，表明藥物與磷脂膜之間的作用力以氫鍵、靜電力等為主，而疏水作用為輔。

我們的前期工作已經測定了檸檬酸鐵脂質體(FAC-Lip)和血紅素鐵脂質體(Heme-Lip)的脂質體-水分配系數、藥物與脂質體膜層之間的作用力類型及吉布斯自由能26。在此基礎上，我們制備了納米白藜蘆醇脂質體(RES-Lip)，測定RES-Lip的Po/w和Plip/w，觀察藥物在生物膜表面分配情況并分析藥物與脂質體膜的作用力類型及吉布斯自由能。研究結果可指導納米脂質體的合成，預測藥物的體外釋放及體內吸收，并為在體實驗提供實驗指導。

2 實驗部分

2.1 材料與主要儀器

白藜蘆醇(純度 ＞ 98%)，上海源葉生物科技有限公司；大豆卵磷脂(PC，純度 ＞ 75%)，北京源華美磷脂科技有限公司；膽固醇(chol，純度 ＞ 95%)，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，生物科技發展有限公司。RE-2000旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；微量移液器，德國Eppendorf公司；CPS2超聲波粉碎機，寧波新芝超聲有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司；TGL-18-B高速離心機，湖南星科科學儀器有限公司；U-3010紫外-可見分光光度計，日本日立公司；JEM100SX透射電子顯微鏡(TEM)，日本日立公司。

2.2 RES-Lip的制備

采用旋轉薄膜蒸發-超聲法制備納米白藜蘆醇脂質體(RES-Lip)混懸液。按照一定膜材比：卵磷脂和膽固醇質量比(mPC:mChol= 5 : 1，8 : 1，10 :1，12 : 1)、藥脂比(RES與卵磷脂質量比：mRES:mPC=1 : 25，1 : 40，1 : 50，1 : 60)準確稱量，加入適量無水乙醇將其溶解，待其完全溶解后轉移至圓底燒瓶，置于45 °C旋轉蒸發儀上旋轉蒸發，直至乙醇完全揮發并形成均勻透明的薄膜。量取磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH = 7.4) 10 mL，倒入上述圓底燒瓶中進行水化洗膜，即可得到RES-Lip混懸液。水浴超聲處理，再將混懸液至于透析袋中，避光透析，除去未包封的RES，所得產物RES-Lip密封保存于4 °C的冰箱中備用。

2.3 RES-Lip的形貌及粒徑分布

用移液槍吸取1滴已稀釋的新制備的RES-Lip混懸液，滴在鍍膜的銅網表面，自然晾干，再用4%磷鎢酸溶液對脂質體進行負染30 s，最后將晾干的銅網放在透射電鏡下觀察RES-Lip微觀形貌。

用二次水將RES-Lip稀釋10倍，超聲后使用激光粒度儀測粒徑。

2.4 RES-Lip包封率的測定

首先配制一系濃度梯度的RES標準溶液，用紫外分光光度計測在其最大吸收波長306 nm處的吸光度，繪制成吸光度與濃度的標準曲線。

取RES-Lip (mPC:mChol= 10 : 1，mRES:mPC=1 : 40)透析液，用紫外分光光度計測其在306 nm處的吸光光度值，代入標準曲線方程計算相應的RES含量。按(1)計算RES-Lip的包封率(EE%)。

2.5 RES-Lip平衡時間的測定

對2.2節中制備的RES-Lip進行平衡透析，測定不同時間t下透析液中RES的濃度，得到平衡曲線，確定平衡時間。

2.6 RES-Lip脂質體-水分配系數的測定

按文獻26的方法，取適量的RES-Lip放入透析袋，采用平衡透析法，室溫測定透析液中RES的濃度，按公式(2)求算lgPlip/w值。

其中Vl為 RES-Lip的體積(L)，C1是RES-Lip包封的質量濃度(g·L?1)，C2是透析液中RES的質量濃度(g·L?1)，VL是脂質體磷脂雙分子層的體積(L)，此值按文獻27計算，lgPlip/w為RES的脂質體-水分配系數的對數值。

2.6.1 膜材比對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響

按2.2節的方法制備不同膜材比(mPC:mChol=5 : 1，8 : 1，10 : 1，12 : 1)的RES-Lip，按上述方法分別求算其對應的lgPlip/w。考察膜材比對RESLip脂質體-水分配系數的影響。

2.6.2 藥脂比對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響

按2.2節的方法制備不同藥脂比(mRES:mPC=1 : 25，1 : 40，1 : 50，1 : 60)的RES-Lip，按上述方法分別求算其對應的lgPlip/w。考察藥脂比對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響。

2.6.3 pH值對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響

等體積量取不同pH值(4.50、5.01、5.62、6.02、6.50、7.02、7.41、8.03)的RES-Lip放入透析袋中，按上述方法分別求算其對應的lgPlip/w。

2.7 RES-Lip油-水分配系數的測定

將文獻24中的測定方法略加改動，等體積量取不同pH值(4.50、5.01、5.62、6.02、6.50、7.02、7.41、8.03)的RES-PBS緩沖溶液和相應pH的正辛醇在小燒杯中混合，磁力攪拌2 h，室溫放置30 min，取下層水相離心15 min (離心力2000g)。用紫外分光光度計分別測定分配前后水相中RES的濃度，二者之差即為RES在正辛醇相中的濃度。按公式(3)計算lgPo/w值。

圖1 RES-Lip的透射電鏡圖(a)和粒徑分布(b)Fig. 1 TEM images (a) and size distribution (b) of RES-Lip.

其中Co和Cw分別代表RES分配在油水兩相中的質量濃度，lgPo/w即為油-水分配系數對數值。

2.8 RES與脂質體膜層之間吉布斯自由能的測定

按文獻26,28記載的方法，在25 °C條件下，檢測透析平衡時脂質體中藥物濃度和透析液中的藥物濃度，按公式(4)、(5)計算藥物與脂質體磷脂雙分子層之間的吉布斯自由能(ΔG)：

其中Kapp是表觀常數，Xb是平衡時脂質體中藥物濃度(mg·mL?1)，Pf是平衡時透析液中的藥物濃度(mg·mL?1)，z是藥物所帶的電荷(C)，F是法拉第常數(C·mol?1)，Ψ是脂質體zeta電位(mV)。

3 結果與討論

3.1 RES-Lip的形貌及粒徑分布

圖1a為RES-Lip的透射電鏡圖，從圖中可以看出，脂質體為球形囊泡，分散較為均勻，并且脂質體的粒徑大部分在100 nm以下。研究表明，與粒徑為1-100 μm的普通脂質體相比，小粒徑(＜ 200 nm)的脂質體在穿透性能和體內被動靶向性等方面具有更大的優勢29。

圖1b為RES-Lip的粒徑分布圖，由圖可知，RES-Lip的粒徑為100 nm左右，與圖1a結果一致。

3.2 RES-Lip的工作曲線和包封率

用紫外分光光度計測在其最大吸收波長306 nm處的吸光度，繪制成濃度與吸光度的標準曲線如圖2所示，由圖2看出RES 的工作曲線方程為A=0.1192C? 0.01171，R2= 0.9994即在0.1500-15.0000 μg·mL?1范圍內有良好的線性關系，根據公式(1)就算出RES-Lip (mPC:mChol= 10 : 1，mRES:mPC= 1:40)的包封率為90.72 ± 1.24。

3.3 RES-Lip的平衡時間

圖2 RES-Lip的標準曲線Fig. 2 Standard curve of RES-Lip.

圖3 RES在脂質體-水相中平衡分配時間Fig. 3 Equilibrium partition time of RES in the phases of liposome and water.

測定不同時間時透析液中RES的濃度，得到RES-Lip在脂質體-水相中平衡曲線如圖3所示，開始時RES濃度波動較大，但隨著時間的延長，4 h后RES濃度波動逐漸減小，呈基本穩定的狀態，因此認為當t≥ 4 h時，RES-Lip在脂質體-水相中達到平衡。

3.4 RES-Lip脂質體-水分配系數的測定

3.4.1 膜材比對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響

圖4為膜材比不同時RES-Lip的lgPlip/w，從圖中可以看出，隨著膜材比的增加lgPlip/w值呈現先增大后減小的趨勢，這是由于加入適量的膽固醇提高了RES-Lip的穩定性，減少藥物的泄露；但膽固醇的含量過高，會使脂膜剛性增加，排列緊密30,31，藥物難以進入脂質體磷脂雙分子層中，因此lgPlip/w會減小。從圖上可以看出，當膜材比分別為10 : 1，RES-Lip的lgPlip/w最大，說明此時藥物與磷脂膜之間的作用力也最大。

3.4.2 藥脂比對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響

圖5為藥脂比不同時RES-Lip的脂質體-水分配系數lgPlip/w。從圖中可以看出，隨著藥脂比的增加lgPlip/w呈現先增大后減小趨勢。這是因為在其他條件固定的情況下，隨著藥物的增加，可以進入脂質體雙分子層的藥物也隨之增加了；當藥物量達到一定時，脂質膜層的包封量達到最大，藥物不能繼續分配進入脂質體膜層中。藥脂比為1 : 40時，lgPlip/w最大，說明此時藥物與磷脂膜間的作用力最大。

3.4.3 pH對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響

圖6a為RES-Lip在不同pH緩沖溶液中的脂質體-水分配系數lgPlip/w，從圖中可以看出，lgPlip/w隨體系pH的增加而減小，即RES在脂質體中的分配減小，當體系的pH在5-7.5之間時lgPlip/w變化比較緩慢，說明這個范圍有利于制備RES-Lip。Plip/w反映的是多種力的綜合作用，包括疏水作用、氫鍵、靜電作用等。為了能更加準確的判斷RES與磷脂膜之間的作用力類型，我們還測定了RES的油-水分配系數。

圖4 膜材比對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響Fig. 4 Effect of membrane material ratio on the liposome/water partition coefficients of RES-Lip.

圖5 藥脂比對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響Fig. 5 Effect of lipid to drug ratio on the liposome/water partition coefficients of RES-Lip.

圖6 RES-Lip的脂質體-水分配系數lgPlip/w (a)和油-水分配系數lgPo/w(b)隨pH的變化趨勢Fig. 6 The trend of liposome/water coefficients lgPlip/w(a) and the n-octanol/water coefficients lgPo/w (b) of RES-Lip with pH.

3.5 RES油水分配系數的測定

圖6b為RES的油-水分配系數隨lgPo/w隨pH的變化趨勢，由圖可知，RES的lgPo/w隨pH的增加而減小，即lgPo/w和lgPlip/w變化趨勢相同，由于lgPo/w主要反映的是疏水-疏水相互作用，與文獻24結果一致，所以可以說明RES與磷脂雙分子層的作用力以疏水作用為主，而氫鍵和靜電作用等其他作用為輔。

表1 透析平衡時RES-Lip的相關參數及ΔGTable 1 The parameters and ΔG of RES-Lip at dialysis equilibrium.

3.6 RES與脂質體膜層之間吉布斯自由能的測定

由圖3可知，平衡透析4 h時，RES在脂質體-水相中達到平衡，此時RES-Lip的相關參數Xb、Pf、T、Ψ見表1，將其帶入公式(4)、(5)中可得RES-Lip中藥物與脂質體膜之間的吉布斯自由能(ΔG)為?17.07 kJ·mol?1。與我們前期所測定的FAC-Lip和Heme-Lip中藥物與脂質體膜的吉布斯自由能(?12.7 kJ·mol?1和?18.2 kJ·mol?1)結果類似26。Russell28和全東琴32等研究表明，藥物與磷脂雙層膜之間吉布斯自由能的大小能反映藥物與膜之間結合的難易程度，ΔG越小，體系越穩定，藥物與磷脂膜越容易結合。因此，表明在我們的實驗條件下，RESLip的制備比較容易。

4 結論

本實驗采用薄膜旋轉蒸發法-超聲法成功制備了納米白藜蘆醇脂質體(RES-Lip)，并對產物進行表征，探究了體系pH值、膜材比和藥脂比對RES-Lip脂質體-水分配系數的影響、藥物與脂質體膜之間的作用力類型和吉布斯自由能。結果發現，隨著膜材比和藥脂比例的增加，lgPlip/w均呈現先增大后減小的趨勢；而隨著pH的增加lgPo/w和lgPlip/w均呈減小趨勢，說明RES與磷脂膜之間的作用力以疏水作用為主。并且當膜材比為10 : 1，藥脂比為1 : 40時，lgPlip/w最大，說明此時RES與磷脂膜間的疏水作用力最大。通過計算得到RES-Lip中RES與磷脂膜之間的吉布斯自由能為?17.07 kJ·mol?1，這表明RES容易包封到脂質體中。本實驗可為載藥脂質體的制備、體外釋放及藥物在生物體的藥代動力學研究提供參考。