苦碟子總黃酮提取純化工藝研究

劉 芳 武 勇 周應(yīng)軍 譚衛(wèi)忠

1.長治醫(yī)學(xué)院，山西長治 046000；2.山東福牌阿膠股份有限公司，山東濟(jì)南 250100；3.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，湖南長沙 410083；4.國藥控股濟(jì)南有限公司，山東濟(jì)南 250116

苦碟子為菊科植物抱莖苦荬菜Ixeris sonchifolia（ Bge.） Hance 的干燥全草[1]，在中國、朝鮮、日本、俄羅斯等國均有分布，我國主要分布于東北及內(nèi)蒙古等地，收錄于《全國中草藥匯編》?？嗟游犊?、辛、性寒，能止痛、清熱、解毒、消腫，主治頭痛，牙痛，胃腸痛及外傷、中小手術(shù)后頭痛[2]。在民間常被用作野菜、飼料，近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)主要含有黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類、三萜類、核苷類、有機酸類等化合物[2]，其中黃酮類化合物含量較高，主要有木犀草素、芹菜素及其苷類[3-7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，苦碟子黃酮類成分能通過增強機體對自由基的清除能力，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，解除冠脈痙攣，減少血小板聚集， 減輕心肌梗死，缺血心肌FFA 含量，從而對心肌缺血/再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[8-10]?？嗟涌傸S酮通過拮抗細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減少自由基的產(chǎn)生，抑制NO 生成，產(chǎn)生對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[11-12]。因此縮短提取純化工藝，提高總黃酮的提取率，具有非常重要的意義。

本實驗采用適合于工業(yè)生產(chǎn)成本低、便于操作的水提醇沉法對苦碟子總黃酮的水提醇沉工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并采用聚酰胺樹脂純化總黃酮粗提物，通過不同條件下聚酰胺樹脂對苦碟子總黃酮動態(tài)吸附與解吸特性的研究，確定最佳純化工藝。本工藝具有操作簡單、方便、安全，成本低、效率高的特點，為苦碟子總黃酮工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試劑

TU-1810 型紫外-可見分光光度計（ 北京普析通用有限公司），AUW220D 十萬分之一電子分析天平（日本島津公司），KQ 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率250W，頻率40kHz），F(xiàn)D-A10N-50 型冷凍干燥機[冠森生物科技（上海）有限公司]。

苦碟子藥材采自黑龍江哈爾濱，由作者鑒定為菊科植物抱莖苦荬菜I.sonchifolia （ Bge.） Hance的干燥全草，蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111528-200606）。聚酰胺（60 ～80 目，青島海洋化工廠）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦碟子總黃酮的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取105℃的干燥至恒重的蘆丁對照品20.4mg，精密稱定，置25mL 容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，濃度為0.8160mg/mL，作為對照品儲備液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 精密吸取蘆丁對照品儲 備 液1、2、3、4、5mL 分 別 置 于25mL 容 量 瓶 中，加60%乙醇至刻度，搖勻，濃度分別為0.03264、0.06528、0.09792、0.13056、0.1632mg/mL。分別取5mL 置于10mL 容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3mL，搖勻，放置6min。再加入10%硝酸鋁0.3mL，搖勻，放置6min 后，加入1mol/L 的氫氧化鈉4mL，用60%乙醇稀釋至10mL，搖勻，靜置10min。同時取各對照品溶液5mL，加60%乙醇稀釋至10mL，靜置10min，作為空白。采用分光光度法，在波長505nm 處測定吸光度。以吸光度（A）值對濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=6.4430C+0.0001，r=0.9999，線性范圍為32.64 ～163.2μg/mL。

2.1.3 樣品測定 精密吸取供試品溶液，按2.1.2項下方法測定各供試品溶液的吸光度值，測定3 次，取其平均值，根據(jù)回歸方程計算供試品溶液中苦碟子總黃酮的含量。

2.2 苦碟子總黃酮的提取工藝

2.2.1 正交試驗因素與水平設(shè)計 根據(jù)預(yù)試驗，選擇影響苦碟子總黃酮提取的加水量、提取時間、溶液pH 值、醇沉體積4 個因素，以提取液中苦碟子總黃酮的含量為指標(biāo)，采用L9（34） 正交表進(jìn)行實驗設(shè)計（見表1），優(yōu)選最佳工藝參數(shù)。

表1 正交試驗因素水平表

2.2.2 提取工藝考察 取干燥苦碟子藥材粉末（過40 目篩）約50g，置圓底燒瓶中，按表2 正交試驗設(shè)計的加水量、提取時間，加熱回流提取兩次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至相當(dāng)于含生藥1g/mL 的溶液。加鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至規(guī)定值，加規(guī)定體積的90%乙醇充分?jǐn)嚢韬?，冰箱靜置過夜，離心（2500r/min，5min），取上清液減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至相當(dāng)于含生藥1g/mL 的溶液，測得其總黃酮含量。

2.2.3 正交試驗結(jié)果 各因素的影響程度依次為的主次因素為A ＞D ＞B ＞C，即加水量＞醇沉體積＞提取時間＞溶液pH 值。本試驗結(jié)果分析得出最佳條件為A2B2C2D2，加10 倍量水，加熱回流提取兩次，分別為1h、0.5h，過濾，合并，濃縮后加鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2，加入4 倍量90%的乙醇進(jìn)行沉淀。方差分析可知，四因素均無顯著性影響。見表2。

2.2.4 苦碟子總黃酮提取工藝驗證試驗 根據(jù)優(yōu)選得到的最佳工藝條件提取苦碟子總黃酮3 批，減壓濃縮至小體積后冷凍干燥，稱定凍干粉重，計算凍干粉中總黃酮的含量，并計算轉(zhuǎn)移率，見表3，凍干粉中總黃酮平均含量為15.28%，平均轉(zhuǎn)移率為75.85%，表明該提取醇沉工藝穩(wěn)定、可行、重現(xiàn)性好。

2.3 聚酰胺樹脂純化苦碟子總黃酮的工藝研究

2.3.1 聚酰胺的預(yù)處理 取聚酰胺樹脂，過60 目篩。將樹脂用蒸餾水充分淋洗，瀝干，用95%乙醇浸泡24h，濕法裝柱；依次用50%，20%乙醇淋洗，洗至不呈白色渾濁為止，再以蒸餾水洗至無醇味，倒出，置于烘箱中90℃烘干，備用。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3.2 樹脂粒度的考察 取已處理好的30 ～60目、60 ～80 目、80 ～100 目的聚酰胺樹脂約5g，濕法裝入內(nèi)徑為1.0cm 的色譜柱中（柱體積約33mL），以2mL/min 的流速，加入60mL 苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5mg/mL 的溶液），收集流出液。精密吸取流出液3mL 加水稀釋至25mL，按2.1 項下方法測定流出液中總黃酮的含量，計算吸附量與吸附率。靜置吸附2h 后，蒸餾水洗脫60mL，棄去；再0.03%氨水洗脫90mL，收集洗脫液，精密吸取1mL放入50mL 容量瓶中加0.03%氨水稀釋至刻度，按2.3 項下方法測定其吸光度值，計算解吸量與解吸率。見表4。

注：Qa吸附量（mg/g），Ra吸附率（%），Qd解吸量（mg/g），Rd解吸率（%），C0上樣溶液質(zhì)量濃度（mg/mL），Cr流出液質(zhì)量濃度（mg/mL），V 上樣溶液體積（mL），W 干樹脂質(zhì)量（g），Cd解吸液濃度（mg/mL），Vd解吸液體積（mL）

結(jié)果顯示，隨著聚酰胺粒徑的增大，總黃酮的吸附量及吸附率均呈上升趨勢，但80 ～100 目聚酰胺的解吸量與解吸率由于形成死吸附而降低，因此選擇動態(tài)吸附及解吸率均較最高的60 ～80 目聚酰胺進(jìn)行純化。

2.3.3 上樣溶液濃度的考察 按2.3.2 項下具體操作，以2mL/min 的流速，分別加入總黃酮含量為8.59、5.73、2.29、1.14mg/mL 苦 碟 子 提 取 溶 液（相當(dāng)于將含生藥1g/mL 的溶液分別稀釋至含生藥0.75、0.5、0.2、0.1g/mL 的提取溶液）。收集餾分，每10mL 為一管，測定總黃酮含量，計算泄漏率。泄漏率達(dá)10%停止上樣，計算吸附量與吸附率。靜置吸附2h 后，蒸餾水洗脫60mL，棄去；再0.03%氨水洗脫90mL，收集洗脫液，計算解吸量與解吸率。見表5。

注：Rl解吸率（%），C0上樣溶液質(zhì)量濃度（mg/mL），Cr流出液質(zhì)量濃度（mg/mL）

表5 上溶液濃度考察結(jié)果

由結(jié)果可見，當(dāng)泄漏率約為10%時，隨上樣溶液濃度的增加，吸附量增加，并且達(dá)飽和時間縮短，但是當(dāng)上樣溶液達(dá)到一定濃度時，由于溶液粘稠，在柱頂形成死吸附而不能解吸，使得解析率反而下降。因此選擇含生藥5.73mg/mL 為最佳上樣溶液濃度（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）的溶液，上樣體積為70mL（約相當(dāng)于2BV）。

2.3.4 上樣流速的考察 按2.3.2 項下具體操作，分別以1、2、3mL/min 的流速上樣，加入苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）。收集流分，每10mL 為一管，測定總黃酮含量，計算泄漏率。當(dāng)泄漏率達(dá)10%時停止上樣，計算吸附量與吸附率。由表6 可見，流速在1 ～3mL/min 時，樹脂的吸附量隨體流速的增大而下降，流速過大，吸附量下降，提早泄漏；流速過小，樹脂的吸附量大，但是達(dá)飽和時間延長，工作效率降低。同時兼顧工作效率和吸附效果，選擇2mL/min 為最佳流速，上樣體積70mL（約相當(dāng)于2BV）時達(dá)飽和。

表6 上樣流考察結(jié)果

2.3.5 沖洗雜質(zhì)溶劑用量的考察 按2.3.2 項下具體操作，以2mL/min 的流速加入70mL 苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）。飽和吸附后，靜置2h，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。每10mL 為一管，測定洗脫液中總黃酮含量。結(jié)果顯示，總黃酮在40mL 水洗脫時產(chǎn)生了流失，之后樹脂對黃酮進(jìn)行了很好的富集，不再洗脫下來。水洗后總黃酮的損失率為3.24%，經(jīng)過60mL 水洗脫后無色，可有效的去除極性較大的雜質(zhì)，提高總黃酮純度。見表7。

表7 沖洗雜質(zhì)溶劑用量考察結(jié)果

2.3.6 洗脫溶劑的考察 按2.3.2 項下具體操作，以2 mL/min 的流速加入70mL 苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）。飽和吸附后，靜置2h，先用蒸餾水洗脫60mL，棄去；再分別以30%、50%、70%乙醇水溶液、0.03%氨水各90mL 洗脫，收集洗脫液，計算解吸量與解吸率。見表8。

表8 洗脫溶劑考察結(jié)果

黃酮類化合物解吸常用的洗脫劑有不同濃度乙醇和堿液，試驗結(jié)果表明在相同的洗脫體積下，隨著醇濃度的增加，解吸率在增高，但0.03%氨水的洗脫能力最強，解吸率最高。因此選擇0.03%氨水溶液為洗脫劑。

2.3.7 洗脫溶劑體積的考察 按2.3.2 項下具體操作，以0.03%氨水為洗脫溶劑，收集餾分，測定總黃酮含量，計算解吸量與解吸率。由表9 結(jié)果可知，隨著洗脫溶劑體積的增加，苦碟子總黃酮的解吸率也隨之增加，但洗脫溶劑用量超過90mL 后，解吸率增加趨于平緩，因此選擇90mL（約相當(dāng)于3BV）為洗脫溶劑體積。

表9 洗脫溶劑體積考察結(jié)果

2.3.8 驗證試驗 按2.3.2 項下具體操作，以2mL/min的流速加入70mL 苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）。飽和吸附后，靜置2h，先用蒸餾水洗脫60mL，棄去；再分別0.03%氨水各90mL 洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮含量，計算解吸量與解吸率。洗脫液減壓濃縮至小體積后冷凍干燥，稱定，計算總固體物中總黃酮的含量。

由表10 結(jié)果可知，通過聚酰胺分離純化，凍干粉中苦碟子總黃酮含量可達(dá)51.98 %，比提取醇沉后總黃酮含量15.28%，提高了2.4 倍，說明采用聚酰胺樹脂可以富集純化苦碟子提取物中的總黃酮，轉(zhuǎn)移率為64.15%。

表10 驗證試驗結(jié)果

2.4 工藝放大

取已處理好的60～80 目的聚酰胺樹脂約50g，濕法裝入內(nèi)徑為7.0cm 的色譜柱中（柱體積約360mL），以2mL/min 的流速加入苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）2BV。飽和吸附后，靜置2h，先用2BV 蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；再以0.03%氨水洗脫3BV，收集洗脫液。減壓濃縮至小體積后冷凍干燥，稱定，計算總固體物中總黃酮的含量。見表11。

表11 工藝放大結(jié)果

3 討論

苦碟子中主要含有木犀草素、芹菜素等黃酮及其苷類化合物，此類化合物在70%乙醇中溶解良好，同時在熱水中有較好的溶解性。在預(yù)實驗中進(jìn)行了醇提實驗，采用70%乙醇，10 倍量提取兩次，每次1h，合并兩次提取液，經(jīng)測定苦碟子總黃酮含量為1.45%，與水提液無明顯差異。又考慮到水提取較為方便，安全，成本較低，且臨床方劑及原苦碟子注射液的提取工藝也采用水提取的方法，因此本文采用水作為提取溶媒。

本文采用正交設(shè)計法對苦碟子總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提取液中總黃酮含量為指標(biāo)，通過對影響提取工藝的加水量、提取時間、溶液pH 值和醇沉體積等因素進(jìn)行考察，最終確定最佳的提取工藝條件為：加10 倍量水，加熱回流提取兩次，分別為1h、0.5h，過濾，合并，濃縮后加鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2，加入4 倍量90%的乙醇進(jìn)行沉淀，離心（2500r/min，5min），取上清液減壓濃縮至無醇味，加蒸餾水稀釋至相當(dāng)于含生藥0.5g/mL 的溶液（適于聚酰胺純化上樣溶液濃度）。該方法具有能耗小、提取效率高的特點，且經(jīng)過驗證該工藝穩(wěn)定、可行。

總黃酮的純化一般采用大孔吸附樹脂[13]、聚酰胺樹脂[14]以及不同樹脂聯(lián)用[15-16]等吸附解析的方法。聚酰胺樹脂是由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，它通過氫鍵和范德華力對黃酮類化合物有較強的吸附性能[17]。本研究對比了不同粒徑的聚酰胺樹脂苦碟子總黃酮的吸附能力和解吸附能力，優(yōu)選了60～80 目聚酰胺樹脂富集苦碟子總黃酮。并采用單因素比較法對上柱溶液濃度及體積、流速、沖洗雜質(zhì)溶劑用量、洗脫溶劑、洗脫溶劑體積等進(jìn)行了考察，確定了最佳的純化工藝：以2mL/min 的流速加入含生藥0.5g/mL 苦碟子提取溶液2BV，飽和吸附后靜置2h，先用2BV 蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；再以0.03%氨水洗脫3BV，收集洗脫液。經(jīng)放大工藝，苦碟子提取物經(jīng)聚酰胺純化得到的總黃酮含量達(dá)50%以上。

本研究建立了工藝簡單、穩(wěn)定、可行的苦碟子總黃酮的提取純化方法，為苦碟子總黃酮的進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)和開發(fā)利用提供一定的實驗基礎(chǔ)。