熒光定量PCR法與膠體金法檢測沙眼衣原體的比較

吳勝星 黎運西 潘錦玲

廣東省中山市陳星海醫院，廣東中山 528467

據有關資料顯示，沙眼衣原體（chlamydia trachomatis，CT）是性疾病傳播的主要病原體。目前，我國CT 感染率越來越高，其主要是因為頻繁感染、抗生素使用不合理引起的[1]。男性CT 感染后，極易出現前列腺炎、附睪炎及尿道炎等；而女性在感染CT 后，很容易出現子宮內膜炎、宮頸炎、盆腔炎、尿道炎及前庭大腺炎等[2]，與此同時，部分則會合并慢性盆腔痛、異位妊娠、肛周炎及不孕癥等并發癥[3]。此外。因為CT 造成的慢性子宮頸炎也是誘發宮頸癌的主要因素[4]。本研究主要針對熒光定量PCR 法與膠體金法在沙眼衣原體檢測中的應用效果進行深入分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采集本院2017 年3 月～2018 年3 月接收的200 例進行婚前檢查人群的標本，分別是尿液標本與宮頸分泌物。年齡22 ～30 歲，平均（26.4±0.9）歲。病理檢查結果：10 例惡性，190 例良性。經醫院倫理委員會批準；納入標準：（1）具備完整臨床資料；（2）具備正常溝通、理解能力；（3）自愿簽署知情研究同意書。排除標準：（1）合并肝臟、心臟及腎臟功能障礙；（2）存在精神異常及心理障礙；（3）合并傳染疾病史；（4）伴有凝血功能障礙者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 針對女性疑似病患標本，采集過程中，首先，對受檢人員局部皮膚進行消毒，在受檢人員尿道口插入經滅菌處理的棉拭子，深度控制在2cm 左右，停留大約10s，旋出棉拭子。在外陰位置出現部分病癥后，利用棉拭子擦取周圍分泌物，如果是陰道分泌物，擦拭留取可采用無菌長棉拭子。每位患者標本采集兩份，一份立即采用膠體金法檢查，另一個熒光定量PCR 法檢測。針對男性：首先，全面消毒尿道局部皮膚，然后反轉包皮，通過專用的拭子對標本進行擦取；針對尿液標本，采用同樣方法全部消毒局部皮膚，然后清洗包皮留樣本。

1.2.2 儀器和試劑 CT 核酸檢測試劑盒（潮州凱普生物化學有限公司）、CT 抗原檢測試劑盒（立明衣原體快速檢測試劑）。儀器有低溫高速離心機和上海宏石SLAN-96P 熒光定量PCR 儀器。

1.2.3 方法 通過熒光定量PCR 法及膠體金法對CT 進行檢測。熒光定量PCR 法：嚴格按照試劑說明書操作。將有細胞保存液的樣本管在渦旋振蕩器上充分振蕩混勻，取800μL 樣本加入1.5mL離心管，13000r/min 離心1min，棄上清液。加入500μL 細胞保存液，振蕩混勻，13000r/min 離心1min，棄上清液。加入50μL 細胞裂解液，振蕩混勻，100 ℃加 熱10min，13000r/min 離 心10min，保留上清備用。取上清2μL 作為PCR 擴增的模板，上機檢測。最后儀器自動標出標準曲線，標準曲線相關系數r ＞0.990，外部質控、陽性對照、標準品均為陽性，陰性對照的CT 值無任何數值，可判斷實驗結果有效，否則實驗無效。

膠體金法：根據沙眼衣原體抗原檢測試劑說明書開展，裂解樣本獲得沙眼衣原體抗原，將含有抗原的裂解后溶液添加到膠體金試劑的加樣孔內，10 ～20min 后讀取數據。質控位置和測試位置均出現紫紅色條帶，表示樣品中含有沙眼衣原體。

1.3 觀察指標

分析膠體金法與熒光定量PCR 法檢測CT結果。

1.4 統計學方法

2 結果

CT 檢測過程中，熒光定量PCR 檢測敏感度、特異度和準確度分別為100%（182/182）、55.56%（10/18）和96.00%（192/200）；膠體金法檢測敏感度、特異度和準確度分別為95.60%（174/182）、61.11%（11/18）、91.00%（185/200），熒 光 定 量PCR 檢測準確率比膠體金法高，差異有統計學意義（χ2=3.983，P=0.046），見表1。

表1 分析膠體金法與熒光定量PCR檢測CT結果

3 討論

近年，沙眼衣原體（CT）感染深受全球范圍的重視，而且感染人數越來越多。據有關資料顯示[3]，全球至2008 年，新發現沙眼衣原體感染患者達到1.06 億，到2010 年，全球新感染CT 患者已經達到2.15 億。特別是廣東省，生殖道沙眼衣原體感染率不斷提高。相關研究顯示[5]，沙眼衣原體感染無癥狀患者中，70%為女性，而50%為男性。若未及時診治，很容易造成逆行感染，女性則會出現死胎、盆腔炎、流產、輸卵管炎及不孕不育等[6]；而男性則會出現不育、附睪炎及前列腺炎等。所以，應及早診斷和篩查沙眼衣原體[7]。CT 是泌尿生殖道感染常見的一種病原體，常用檢測方法有免疫膠體金法、涂片法、藥敏培養法及細胞培養法等。細胞培養法被視為檢測CT 的金標準[8]。但是，因為常見檢測方法需要長時間，且可靠性差、敏感性低，進而通常無法為臨床診治提供重要參考數據，而熒光定量PCR 法可擴增目的基因，雜交特異分子，且融合了化學熒光發光法，于封閉環境中，可進一步增加過程中，分析產物[9]。與此同時，利用計算機調控，可達到動態及自動化檢測，具有較高的檢測靈敏性，而且準確性高，可在短時間內完成檢測[10]。

隨著熒光定量PCR 技術的發展，其被應用于基因檢測中，而且該方法隨著基因產物的增加熒光信號強度越來越強，所以，應于每次循環后對一次熒光信號進行收集，其可以獲取熒光擴增曲線[11]。擴增曲線包括三個階段，分別是平臺期、熒光信號指數階段及熒光背景信號極端[12]。所以，在PCR 判定中放入CT 值。在樣本CT 值低于37 時，檢測結果為40 時或者無CT 值時，檢測結果則為陰性。如果CT 值處于37 ～ 40 間，則表示處于灰樣區，說明需要復檢[9]。

經本研究可知，CT 檢測過程中，熒光定量PCR 檢測敏感度、特異度和準確度分別為100%（182/182）、55.56%（10/18）和96.00%（192/200）；膠體金法檢測敏感度、特異度和準確度分別為95.60%（174/182）、61.11%（11/18）、91.00%（185/200），熒光定量PCR 檢測準確率比膠體金法高，差異有統計學意義（χ2=3.983，P=0.046）。由此可見，熒光定量PCR 法在CT 檢測效果方面比膠體金法更優，該方法是一種操作簡單、方便、快捷的檢測方法。因為熒光定量PCR 法在特異性方法存在一定不足，所以，熒光定量PCR 法檢測CT 過程中，應加強對假陽性的重視，避免誤診現象的發生。所以，臨床上應聯合膠體金法與熒光定量PCR 法，將兩者優勢充分發揮出來，促進CT 檢測準確性及敏感性的提高。

據有關資料顯示[13]，常規細胞培養方法是檢測的金標準，在細胞培養結果呈陰性或者陽性而膠體金或者聚合酶連反應檢測結果提示為陽性，則說明該標本檢測結果為陽性。因為本研究條件有限，未進行細胞培養法，所以，只可以用于判定真陽性的依據。

綜上，本研究過程中，無論是熒光定量PCR 法，還是膠體金法，兩者都有著各自的優點和缺點，但是，從整體角度來看，熒光定量PCR 法優點更多，包括操作方便、簡單、檢測時間短、重復性好、準確度高、敏感性高等，而且其可以減輕疼痛，防止標本與標本間的差異。而且通過熒光定量PCR 法可定量檢測病原體，除在疾病診斷中具有效果，而且也可以被應用于監控和調查流行病，并研究分子生物學和遺傳學，除此之外，其同樣可被用于腫瘤疾病預后判定、分型及診斷中[14]。

總而言之，沙眼衣原體臨床檢測過程中，熒光定量PCR 法相比于膠體金法效果更為明顯，其除了具有操作簡單、檢查時間短、方便等特點外，而且其敏感性高，值得推廣、采納。