洋甘菊對(duì)1型糖尿病模型小鼠血糖的影響及其抗血栓作用研究

王 瑩，馬紅梅，蘭 衛(wèi)*，趙翡翠*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830002；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

洋甘菊(Matricariachamomile)為菊科母菊屬，味微苦、甘香，為一年生菊科植物洋甘菊干燥的全草，是新疆地產(chǎn)特色藥材。洋甘菊藥用部位通常為頭狀花序，新疆維吾爾藥以全草入藥[1]。據(jù)《維吾爾常用藥材學(xué)》記載，洋甘菊具有安神、止咳、止瀉、利尿等功效，治療月經(jīng)不通、頭痛、小便不利等[2]。洋甘菊的化學(xué)成分主要有：揮發(fā)油類、黃酮類、愈創(chuàng)薁內(nèi)酯類、香豆素類、多糖、黏液質(zhì)等。洋甘菊具有多種藥理活性，歐洲植物療法科學(xué)合作組織[3]在專著中報(bào)道了洋甘菊花揮發(fā)油中活性成分的藥理活性：抗炎、解痙、抗?jié)儭⒂蟼凇㈡?zhèn)靜、抗菌等。蘭衛(wèi)課題組研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊還具有降血脂[4]、降血糖[5]、體外抗腫瘤[6]、降血壓[7]等藥理活性。

前期研究[5]顯示，洋甘菊提取物對(duì)正常小鼠有降血糖作用，并能改善正常小鼠糖耐量。在此，作者采用四氧嘧啶誘導(dǎo)建立1型糖尿病模型小鼠，考察洋甘菊提取物對(duì)1型糖尿病模型小鼠血糖值、糖耐量的影響，進(jìn)一步明確洋甘菊的降血糖作用；同時(shí)測(cè)定洋甘菊提取物對(duì)正常小鼠凝血時(shí)間、止血時(shí)間的影響和對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠的抗血栓作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥材、試劑與儀器

洋甘菊(Matricariachamomile)，采集于新疆和田地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院李永和主任藥師鑒定為德國(guó)洋甘菊。

鹽酸二甲雙胍(批號(hào)29902)，MedChem Express；四氧嘧啶(批號(hào)87H6738)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma；羅康全活力型血糖試紙(批號(hào)01-130667)，羅氏；紅霉素軟膏(批號(hào)170403)，南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司；水合氯醛(批號(hào)1005412)，武漢和盛化工；阿司匹林腸溶片(批號(hào)J20130078)，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；蒸餾水；其它試劑均為分析純。

SN1445-7153729型血糖儀，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；5430R型離心機(jī)，艾本德(中國(guó))有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津上海公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；微量移液槍，上海玻利鴿公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(新)2011-0004。SPF昆明種小鼠，雌雄各半，體重(20±2) g，批號(hào)20160523；Wistar大鼠，雌雄各半，體重(200±20) g，批號(hào)20160312。

1.3 洋甘菊提取物的制備

洋甘菊醇提物的制備：洋甘菊粗粉經(jīng)70%乙醇回流提取2次，即得洋甘菊醇提物。

洋甘菊水提物的制備： 洋甘菊粗粉用20倍水提取2次，即得洋甘菊水提物。

1.4 洋甘菊提取物對(duì)1型糖尿病模型小鼠血糖值和糖耐量的影響

1.4.1 1型糖尿病模型小鼠的造模、分組與給藥

昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按文獻(xiàn)[8]方法，尾靜脈注射四氧嘧啶(85 mg·kg-1)，以注射等量生理鹽水為對(duì)照，注射后第4 d尾尖取血測(cè)定空腹血糖值，血糖值高于 250 mg·dL-1的小鼠即為造模成功。

將模型小鼠隨機(jī)分為模型組(生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照組(二甲雙胍，200 mg·kg-1)，洋甘菊醇提物高、中、低劑量組(971 mg·kg-1、485 mg·kg-1、243 mg·kg-1，以生藥計(jì)，下同)，洋甘菊水提物高、中、低劑量組(1 366 mg·kg-1、683 mg·kg-1、341 mg·kg-1)，每組10 只；并另選10 只正常小鼠作為正常組(生理鹽水)。

各組小鼠均每日灌胃給藥2 次，連續(xù)給藥30 d。

1.4.2 降糖率和糖耐量的測(cè)定

末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，分別于給藥0 d、10 d、20 d、28 d后尾尖取血，用試紙法測(cè)定各組小鼠血糖值，計(jì)算降糖率。

末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，在0 h尾尖取血，之后給小鼠灌胃葡萄糖(2 g·kg-1)，再于葡萄糖負(fù)荷后0.5 h、1.0 h、2.0 h 取血，用試紙法測(cè)定血糖值，計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)，評(píng)價(jià)洋甘菊提取物對(duì)1型糖尿病模型小鼠糖耐量的影響。

1.5 洋甘菊提取物對(duì)正常小鼠凝血時(shí)間和止血時(shí)間的影響[9]

1.5.1 實(shí)驗(yàn)小鼠的分組與給藥

取正常昆明種小鼠80只，隨機(jī)分成8組：正常組(蒸餾水)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林，80 mg·kg-1)，洋甘菊醇提物高、中、低劑量組(971 mg·kg-1、485 mg·kg-1、243 mg·kg-1)，洋甘菊水提物高、中、低劑量組(1 366 mg·kg-1、683 mg·kg-1、341 mg·kg-1)。

每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

1.5.2 凝血時(shí)間和止血時(shí)間的測(cè)定

末次給藥1 h后，將玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼內(nèi)取血，自血液流入毛細(xì)管內(nèi)開(kāi)始，待血液注滿毛細(xì)管后，每隔30 s折斷毛細(xì)管(約0.5 cm)，觀察毛細(xì)管折斷處是否出現(xiàn)血凝絲，從折斷到血凝絲出現(xiàn)的這段時(shí)間即為凝血時(shí)間。

末次給藥1 h后，固定小鼠，測(cè)量鼠尾長(zhǎng)度，在距離尾尖0.4 cm處橫斷剪開(kāi)，從血液自行溢出開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔30 s用濾紙吸去血滴1次，直至血流自然停止的這段時(shí)間即為止血時(shí)間。

1.6 洋甘菊提取物對(duì)大鼠體內(nèi)動(dòng)脈血栓形成的影響[10]

1.6.1 實(shí)驗(yàn)大鼠的分組與給藥

取Wistar大鼠80只，隨機(jī)分成8組：正常組(蒸餾水)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林，80 mg·kg-1)，洋甘菊醇提物高、中、低劑量組(971 mg·kg-1、485 mg·kg-1、243 mg·kg-1)，洋甘菊水提物高、中、低劑量組(1 366 mg·kg-1、683 mg·kg-1、341 mg·kg-1)。

每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

1.6.2 血栓抑制率的測(cè)定

末次給藥前禁食不禁水12 h，灌胃給藥1 h后，以10%水合氯醛腹腔注射(劑量3 mL·kg-1)麻醉，固定并分離右頸總動(dòng)脈，將完全浸透50%三氯化鐵溶液的濾紙剪成1 cm2大小的濾紙片，環(huán)裹于頸總動(dòng)脈30 min后，取出被包裹的動(dòng)脈段內(nèi)的血栓，精密稱定血栓濕重，并測(cè)量血栓長(zhǎng)度,計(jì)算血栓抑制率(IR)：

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 洋甘菊提取物對(duì)1型糖尿病模型小鼠血糖值的影響(表1)

Tab.1 Effect of Matricaria chamomile extract on blood glucose value of type 1 diabetic model

注：與正常組比較：*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組比較：#表示P<0.05，##表示P<0.01；下表同。

從表1可知，與正常組比較，模型組小鼠給藥前的空腹血糖值均極顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；給藥28 d后，二甲雙胍組、洋甘菊醇提物各劑量組及洋甘菊水提物高、中劑量組小鼠的空腹血糖值較模型組均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)；提取物的所有劑量組中，洋甘菊醇提物高劑量組對(duì)模型小鼠的降糖作用最好，給藥28 d后的降糖率為50.86%。這提示洋甘菊提取物對(duì)1型糖尿病模型小鼠具有一定的降血糖作用。

2.2 洋甘菊提取物對(duì)1型糖尿病模型小鼠糖耐量的影響(表2)

從表2可知，與正常組比較，模型組小鼠在給予葡萄糖0 h、0.5 h、1.0 h、2.0 h 后的血糖值均極顯著升高(P<0.01)，AUC值極顯著增大(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組小鼠在給予葡萄糖0 h、0.5 h、1.0 h、2.0 h后的血糖值均極顯著降低(P<0.01)，AUC值極顯著減小(P<0.01)；洋甘菊水提物高劑量組小鼠在給予葡萄糖0 h、0.5 h、1.0 h、2.0 h后的血糖值均顯著降低(P<0.05)，AUC值顯著減小(P<0.05)；洋甘菊水提物中劑量組小鼠在給予葡萄糖0 h、2.0 h后的血糖值均顯著降低(P<0.05)，AUC值顯著減小(P<0.05)；洋甘菊醇提物各劑量組小鼠在給予葡萄糖0 h、0.5 h、1.0 h、2.0 h后的血糖值均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，AUC值顯著減小(P<0.01或P<0.05)。這提示洋甘菊醇提物和水提物(高劑量)可明顯改善1 型糖尿病模型小鼠的糖耐量。

Tab.2 Effect of Matricaria chamomile extract on glucose tolerance of type 1 diabetic model

2.3 洋甘菊提取物對(duì)正常小鼠凝血時(shí)間和止血時(shí)間的影響(表3)

Tab.3 Effect of Matricaria chamomile extract on clotting time and bleeding time of normal

從表3可知，與正常組比較，洋甘菊醇提物高、中劑量組可顯著延長(zhǎng)正常小鼠凝血時(shí)間和止血時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。這提示洋甘菊醇提物(高、中劑量)可以明顯延長(zhǎng)正常小鼠的凝血時(shí)間和止血時(shí)間。

2.4 洋甘菊提取物對(duì)大鼠體內(nèi)動(dòng)脈血栓形成的影響(表4)

從表4可知，與正常組比較，洋甘菊醇提物各劑量組及水提物高劑量組的大鼠血栓濕重均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照(阿司匹林)組的血栓抑制率為48.69%，洋甘菊醇提物組的血栓抑制率最高可達(dá)42.62%，水提物組的血栓抑制率最高可達(dá)31.00%。

組別劑量/(mg·kg-1)血栓濕重/mg血栓抑制率/%正常組-19.45±3.45-陽(yáng)性對(duì)照組80 9.98±4.48**48.69醇提物高劑量組97111.16±5.65**42.62醇提物中劑量組48512.65±4.78**34.96醇提物低劑量組243 14.86±5.35*23.60水提物高劑量組1366 13.42±4.83*31.00水提物中劑量組68315.27±5.1221.49水提物低劑量組34116.93±4.6812.96

2.5 討論

1型糖尿病較難預(yù)測(cè)及早期診斷，是一種具有遺傳傾向的促炎性自身免疫性疾病。隨著病程進(jìn)展，患者會(huì)出現(xiàn)糖尿病足、糖尿病腎病(DN)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、心腦血管病變等一系列并發(fā)癥。由于1型糖尿病患者胰島β細(xì)胞70%～80%已被破壞，只能依靠長(zhǎng)期注射胰島素治療[11]。 糖尿病在病程中會(huì)出現(xiàn)高黏滯血癥，對(duì)其血管并發(fā)癥有促進(jìn)作用[12]，隨著病程的延長(zhǎng)和惡化，會(huì)引起病人致盲和終末期腎病。研究報(bào)道，中藥及其復(fù)方制劑在抗血栓方面具有良好的藥理作用，如三七、黃芪、赤芍、丹參等均能活血化瘀、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、延長(zhǎng)凝血止血時(shí)間、抗血栓形成[13]。很多具有活血化瘀功效的中藥材，其藥效主要成分為黃酮類化合物，其抗血栓形成及抗血小板作用具有重要價(jià)值，值得深入研究。

3 結(jié)論

建立了1型糖尿病模型小鼠，探究了洋甘菊提取物對(duì)1型糖尿病模型小鼠的血糖和糖耐量的影響及其抗血栓作用。結(jié)果表明，洋甘菊提取物對(duì)外源性葡萄糖導(dǎo)致的血糖升高具有拮抗作用，具有良好的降血糖作用。洋甘菊醇提物(高、中劑量)能明顯延長(zhǎng)正常小鼠凝血時(shí)間和止血時(shí)間，表明抗凝作用顯著；洋甘菊醇提物和水提物對(duì)大鼠的血栓抑制率最高分別可達(dá)42.62%和31.00%，這種抗血栓作用可能與抑制凝血系統(tǒng)的功能有關(guān)，也可能與抑制血小板功能有關(guān)。