紫草素通過TLR4/NF-κB信號通路抑制由LPS誘導的人牙髓細胞炎癥研究

杜暘 金鼎 高秀秋

牙體牙髓病在人類口腔疾病中比較常見，由于齲病等因素導致牙髓產(chǎn)生炎癥，會引起患牙的劇烈疼痛并導致功能障礙，給患者帶來極度的不適，影響生活質(zhì)量[1]。但是，有關牙髓炎癥損傷修復的分子機制目前尚不明確，需進一步探索。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠引起牙髓組織發(fā)生炎癥反應，從而抑制牙髓細胞的增殖、分化等[2]。Toll樣受體 (Toll-likereceptors，TLRs)能識別LPS，是LPS作用受體之一，促進炎癥因子釋放，激活炎癥相關靶基因的表達[3]。核轉錄因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)以非活性的p65/p50/NF-κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB-α，IκB-α)三聚體復合物形式存在于細胞質(zhì)中[4]，可以被多種因素激活，包括LPS和理化因素(X射線、氧化劑及化療藥物制劑)等[5]。在炎癥疾病系統(tǒng)中轉錄因子NF-κB起著關鍵的作用[6]，當炎癥發(fā)生時，炎癥細胞因子大量釋放，如白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)等[7]。TLR4/NF-κB信號通路是否參與了LPS誘導的人牙髓細胞(human dental pulp cells，HDPCs)細胞炎癥目前暫無統(tǒng)一結論，并且開發(fā)能夠拮抗LPS誘導牙髓組織炎癥的天然藥物是迫切解決的問題。

紫草素，又名紫草醌，是植物紫草(Lithospermiun erythrorhizon Sieb.et Zucc)中的一種有效成分，具有較強的抗炎作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，紫草素能抑制炎性反應和促炎因子的釋放，促進巨噬細胞免疫負調(diào)控抑制因子白細胞介素-10(IL-10)的表達。紫草素的抗炎機制可能與TLR4和NF-κB的p65亞基磷酸化有關[11-12]，但具體的分子機制還未發(fā)現(xiàn)。本實驗研究紫草素對LPS誘導HDPCs細胞炎癥的影響，初步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

紫草素(Enzo Biochem，美國)；DMEM低糖培養(yǎng)基、I型膠原酶、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、PBS(Gibco，美國)；脂多糖(LPS)、甲基噻唑基四唑(MTT)(Sigma-Aldrich，美國)；Human IL-1β Platinum Elisa、Human IL-6 Platinum Elisa、Human TNF-alpha Platinum Elisa、Human IL-10 Platinum Elisa(eBioscience，美國)；裂解液、SDS-PAGE配膠試劑盒、BCA蛋白試劑盒(北京康為世紀生物公司)；TLR4、p-NF-κB、β-actin抗體(Cell Signaling，美國)。

1.2 HDPCs體外培養(yǎng)[13]

經(jīng)患者知情同意后，收集錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院口腔科門診就診的患者，由于正畸或者阻生而拔除的完整并且健康的牙齒。在無菌條件下超凈臺中，取出牙髓組織，用PBS反復清洗3 次，剪成小塊，直徑約為0.5 cm，放入含3 mg/ml的I型膠原酶的EP管中，在培養(yǎng)箱中消化30 min，在1 000 r/min條件下，離心5 min，然后棄上清液，加入適量含20% FBS的低糖DMEM原代培養(yǎng)液，然后將組織塊轉移在25 cm2培養(yǎng)瓶中，倒置于5% CO2、37 ℃、相對濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6～8 h后翻瓶，在顯微鏡下觀察細胞是否貼壁，細胞貼壁后，每3 d換液1 次。細胞長至80%時，用0.25%消化胰酶進行消化，1∶2比例進行傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測紫草素和LPS對HDPCs的細胞毒性

取對數(shù)生長期的HDPCs(5×104個/ml)接種于96 孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h，細胞長至70%～80%，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 μl用DMEM培養(yǎng)基稀釋含不同藥物濃度的培養(yǎng)液(紫草素終濃度為0、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L；LPS終濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/ml)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，孵育4 h。吸棄孔中液體，每孔加入150 μl DMSO，搖床上晃動10 min，用多功能酶標儀(Biotek，美國)490 nm測取吸光度，同時設置對照孔，每組設6 個復孔。

1.4 紫草素對LPS誘導的HDPCs炎癥模型細胞存活率的影響

將HDPCs分為4 組，正常對照組(DMEM培養(yǎng)基)、模型組組(培養(yǎng)基中LPS濃度為1 μg/ml)、紫草素低劑量組(培養(yǎng)基中LPS濃度為1 μg/ml+25 μmol/L紫草素)和紫草素低劑量組(培養(yǎng)基中LPS濃度為1 μg/ml+50 μmol/L紫草素)。取對數(shù)生長期的HDPCs(5×104個/ml)接種于96 孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h，細胞長至70%～80%，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，按照上述分組進行給藥，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，孵育4 h。吸棄孔中液體，每孔加入150 μl DMSO，搖床上晃動10 min，于490 nm處進行吸光度檢測，同時設置對照孔，每組設6 個復孔，測定紫草素對HDPCs細胞存活率的影響。

1.5 ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量

取對數(shù)生長期的HDPCs(1×106個/ml)，接種于6 孔板中，按照“1.4”中實驗分組分別加入不同受試物，培養(yǎng)24 h后，收集HDPCs上清液，12 000 r/min離心10 min，吸取上清至EP管中，按照ELISA試劑盒步驟測定IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10水平。

1.6 Western blot法檢測蛋白水平

取對數(shù)生長期的HDPCs(1×106個/ml)，接種于6 孔板中，按照“1.4”中實驗分組分別加入不同受試物，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌2 次，每孔中加入60 μl裂解液，放在冰浴裂解20 min，12 000 r/min離心10 min，獲得總蛋白樣品。BCA法測定蛋白濃度定量后，在蛋白樣品中加入適量SDS-PAGE蛋白緩沖液，金屬浴變性沸騰10 min。上樣量為40 μg，經(jīng)電泳分離后，電轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗抗體TLR4、p-NF-κB和β-actin(β-actin作為內(nèi)參蛋白)，4 ℃過夜，TBS-T洗膜4 次，每次5 min，然后加入對應的熒光二抗，室溫避光孵育2 h，TBS-T洗膜4 次，每次5 min，顯影和掃描使用熒光影像分析儀(LI-COR，USA)。ImageJ 1.41 軟件(Bethesda，美國)進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 紫草素和LPS對HDPCs細胞毒性的影響

如圖1所示，在不同濃度的紫草素和LPS的處理下，HDPCs被藥物作用24 h，在0～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，紫草素對HDPCs基本沒有細胞毒性，濃度超過400 μmol/L時細胞存活率顯著降低。在不同濃度梯度的LPS處理下，結果表明，在0～0.25 μg/ml給藥濃度范圍內(nèi)，沒有產(chǎn)生細胞毒性，當濃度是1 μg/ml時，細胞存活率顯著降低(P<0.01)，說明此濃度的LPS對HDPCs產(chǎn)生細胞損傷，成功建立細胞炎癥模型。

圖1 紫草素和LPS對HDPCs細胞毒性 Fig 1 The cytotoxicity of shikonin and LPS on HDPCs n=6)

2.2 紫草素對LPS誘導的HDPCs細胞炎癥模型細胞存活率的影響

如圖2A所示，與正常組相比，模型組細胞存活率顯著降低(P<0.01)，說明LPS對HDPCs造成炎癥損傷；與模型組相比，在紫草素的作用下，細胞存活率顯著升高(P<0.05)，為劑量依賴性，說明紫草素可以減少LPS引起的炎癥損傷，提高細胞存活率。

2.3 紫草素對LPS誘導的HDPCs中IL-1β水平的影響

如圖2B所示，與正常組相比，模型組IL-1β水平明顯升高(P<0.01)，說明LPS能夠刺激IL-1β細胞炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應；與模型組相比，給藥組中的IL-1β水平顯著降低(P<0.01)，并且存在劑量依賴性，說明紫草素能對抗LPS引起的細胞炎癥，抑制促炎因子IL-1β的釋放。

2.4 紫草素對LPS誘導的HDPCs中IL-6水平的影響

如圖2C所示，與正常組相比，模型組IL-6水平明顯升高(P<0.01)，說明LPS能夠刺激IL-6細胞炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應；與模型組相比，給藥組中的IL-6水平顯著降低(P<0.05)，并且存在劑量依賴性，說明紫草素能對抗LPS引起的細胞炎癥，抑制促炎因子IL-6的釋放。

2.5 紫草素對LPS誘導的HDPCs中TNF-α水平的影響

如圖2D所示，與正常組相比，模型組TNF-α水平明顯升高(P<0.01)，說明LPS能夠刺激TNF-α細胞炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應；與模型組相比，給藥組中的TNF-α水平顯著降低(P<0.01)，并且存在劑量依賴性，說明紫草素能對抗LPS引起的細胞炎癥，抑制促炎因子TNF-α的釋放。

2.6 紫草素對LPS誘導的HDPCs中IL-10水平的影響

如圖2E所示，與正常組相比，模型組IL-10水平顯著降低(P<0.01)，說明LPS抑制IL-10的釋放；與模型組相比，給藥組IL-10水平顯著升高(P<0.05)，呈現(xiàn)劑量依賴性，說明紫草素能夠提高抑炎因子IL-10的釋放，抑制LPS引起的細胞炎癥，具有一定的抗炎作用，并且高濃度的紫草素炎癥的緩解作用較低濃度的紫草素強。

2.7 紫草素對LPS誘導的HDPCs中TLR4蛋白表達的影響

如圖3所示，蛋白印記結果表明，與正常組相比，模型組中TLR4蛋白表達顯著升高(P<0.01)，說明LPS能夠使TLR4蛋白表達升高，發(fā)生炎癥反應，引起HDPCs炎癥損傷；與模型組相比，給藥組中TLR4表達顯著降低(P<0.01)，并且呈劑量依賴性，說明紫草素能夠降低LPS引起的細胞炎癥，降低TLR4蛋白的表達，具有明顯的抗炎作用，并且高劑量紫草素組的作用效果強于低劑量組紫草素組。

2.8 紫草素對LPS誘導的HDPCs中p-NF-κB蛋白表達的影響

如圖3所示，與正常組相比，模型組中p-NF-κB蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，給藥組中p-NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.01)，并且呈劑量依賴性，說明紫草素能夠降低LPS引起的炎癥，降低p-NF-κB蛋白的表達，具有明顯的抗炎作用。

3 討 論

牙髓是牙髓腔內(nèi)疏松的結締組織，具有重要的生理功能，如形成牙本質(zhì)、營養(yǎng)、感覺、修復等，HDPCs則是牙髓組織中重要的細胞器[14]。LPS作為革蘭陰性菌細胞壁的成分之一，能夠誘導促炎細胞因子在牙髓組織中發(fā)生免疫應答[15]，引起牙髓病和齲病[16]，LPS誘導疾病機制可能是通過激活TLR4分子及其下游的NF-κB和MAPK信號通路蛋白的表達[17]，增加炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，抑制IL-10的分泌[18]，然而紫草素具有很強的抗炎作用[19]，能夠抵抗LPS導致的炎癥反應[20]。

A：各組細胞炎癥模型細胞存活率；B：IL-1β分泌水平；C：IL-6分泌水平;D:TNF-α分泌水平;E:IL-10分泌水平圖2 紫草素對LPS誘導的HDPCs細胞存活率，IL-1β，IL-6，TNF-α，IL-10分泌的影響 A：The viability of HDPCs of the groups;B:The release level of IL-1β;C:The release level of IL-6;D:The release level of TNF-α;E:The release level of IL-10Fig 2 The effects of shikonin on LPS-induced HDPCs cell survival and the secretion of IL-1β,IL-6,TNF-α and IL-10 n=6)

A：TLR4蛋白表達；B：p-NF-κB蛋白表達圖3 紫草素對LPS誘導的HDPCs中TLR4及p-NF-κB蛋白表達的影響 A:TLR4 protein expression;B:p-NF-κB protein expressionFig 3 The effects of shikonin on the expression of TLR4 and p-NF-κB in HDPSs induced by LPS n=3)

本研究結果表明紫草素能夠升高由LPS誘導的HDPCs細胞存活率的降低，誘導細胞毒性，引起細胞損傷。在LPS的刺激下，IL-1β、IL-6和TNF-α細胞促炎癥因子的表達顯著升高，IL-10抑炎因子水平顯著降低；TLR4/NF-κB信號通路被激活，TLR4和p-NF-κB蛋白表達顯著升高。在紫草素的治療下，炎癥細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，IL-10抑炎因子水平顯著升高，說明紫草素能夠抑制LPS引起的細胞炎癥，降低促炎因子的釋放，提高抑炎因子的分泌，并且存在劑量依賴性；而且紫草素能夠抑制LPS引起的TLR4/NF-κB信號通路的激活，降低TLR4和p-NF-κB蛋白的表達，由此說明紫草素具有很強的抗炎作用，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號通路來抑制LPS引起的炎癥反應，這將為牙髓病的治療提供新思路和新靶點，有利于開發(fā)治療牙髓病且毒副作用小的天然新藥。