高壓氣腹對(duì)老齡小鼠腹腔探查手術(shù)術(shù)后認(rèn)知功能的影響

胡慈賢 蔣婧妍 孟波 葉海旺 安秀君 李曉瑜 秦金玲 陳駿萍 盧波

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）會(huì)延長(zhǎng)住院時(shí)間，增加住院費(fèi)用，嚴(yán)重影響患者術(shù)后康復(fù)和遠(yuǎn)期生存質(zhì)量，成為老年患者術(shù)后生活障礙和死亡的重要原因。手術(shù)創(chuàng)傷可引起系統(tǒng)性炎癥介質(zhì)釋放，成為引起中樞神經(jīng)炎癥的主要致炎因子，腹腔鏡手術(shù)所必需的高壓力氣腹同樣可造成系統(tǒng)性炎癥介質(zhì)釋放增加[1-2]。鑒于中樞神經(jīng)炎癥與POCD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]，氣腹引起的系統(tǒng)性炎癥介質(zhì)釋放是否會(huì)使手術(shù)麻醉引起的認(rèn)知功能損傷惡化？對(duì)此，目前尚無(wú)相關(guān)研究進(jìn)行分析和探討。因此，本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察腹腔鏡氣腹對(duì)手術(shù)麻醉所致POCD的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性清潔級(jí)ICR小鼠64只，12～14月齡，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究獲得寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于寧波大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要儀器：R540SP型小動(dòng)物麻醉機(jī)（中國(guó)瑞沃德公司）；小動(dòng)物氣腹機(jī)（德國(guó)Karl Storz公司）；條件恐懼行為學(xué)測(cè)試箱（中國(guó)欣軟公司）。

1.2 分組 將64只小鼠隨機(jī)分為正常組（N組）、手術(shù)組（S組）、手術(shù)+低壓氣腹組（L組）和手術(shù)+高壓氣腹組（H組），N組不進(jìn)行任何干預(yù)，S組接受腹腔探查手術(shù)，L組和H組進(jìn)行模擬氣腹實(shí)驗(yàn)后接受腹腔探查手術(shù)。每組再分兩個(gè)亞組（8只一組），分別于手術(shù)后第3天（3d）和第7天（7d）進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

1.3 麻醉方法與圍術(shù)期管理 小鼠術(shù)前禁食24h，不禁飲。使用七氟烷小動(dòng)物麻醉機(jī)，箱內(nèi)七氟烷濃度調(diào)節(jié)至3%后，將小鼠放入箱內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)，直至翻正反射消失，行氣管插管。麻醉維持期調(diào)節(jié)七氟烷濃度為1.8%，空氣流量為0.5L/min，保持自主呼吸，控制麻醉維持時(shí)間為0.5h。

1.4 氣腹實(shí)施和氣腹壓力的設(shè)定 小鼠吸入麻醉后仰臥固定，消毒后將18號(hào)導(dǎo)管針插入左下腹，導(dǎo)管針末端經(jīng)橡皮管接氣腹機(jī)。將另一18號(hào)導(dǎo)管針插入右下腹，導(dǎo)管針末端經(jīng)橡皮管接入一盛水燒杯，腹腔內(nèi)氣體經(jīng)該管排出，盛水燒杯可防止空氣進(jìn)入腹腔，模擬臨床手術(shù)漏氣情況。參照文獻(xiàn)[5]，分別設(shè)定2mmHg為低氣腹壓力，8mmHg為高氣腹壓力。氣腹維持時(shí)間設(shè)定為30min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，關(guān)閉氣腹機(jī)，經(jīng)導(dǎo)管針排出腹腔殘余氣體。

1.5 腹腔探查模型 氣腹實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行腹腔探查手術(shù)。于右肋下垂直于肋骨作一縱行切口，長(zhǎng)約1cm，切口深至腹腔內(nèi)。戴有無(wú)菌外科手套的手指伸入腹腔內(nèi)進(jìn)行探查約30s，取出約10cm的小腸至腹腔外，進(jìn)行摩擦約30s，反復(fù)操作3次。用消毒器械和外科縫合線縫合傷口，切口處以0.5%羅哌卡因浸潤(rùn)鎮(zhèn)痛。整個(gè)麻醉手術(shù)過(guò)程控制在15min以內(nèi)，結(jié)束麻醉后待小鼠自然清醒。

1.6 行為學(xué)測(cè)試 分別于術(shù)后3d和7d開(kāi)始依次進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)（novel object recognition，NOR）和條件性恐懼實(shí)驗(yàn)（fear conditioning，F(xiàn)C）。

1.6.1 NOR NOR 測(cè)試第 1天，將 A、B 兩相同物體放入曠場(chǎng)箱內(nèi)，讓小鼠進(jìn)行探索、訓(xùn)練5min；第2天，將B物體換為不同形狀、質(zhì)地的物體C，記錄小鼠5min內(nèi)對(duì)兩物體的探索時(shí)間（T），并計(jì)算辨別指數(shù)（recognition index，RI）=TC/TA+TC。

1.6.2 FC 小鼠在完成NOR后開(kāi)始進(jìn)行FC。小鼠在無(wú)聲黑暗試驗(yàn)箱內(nèi)適應(yīng)3min后，給予單一高頻聲音（30s，70dB，3kHz）刺激，隨后給予足底電擊（2s，0.7mA）刺激，刺激結(jié)束后恢復(fù)30s，循環(huán)2次后放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束后24h，將小鼠再次放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)自由探索3min，不給予任何刺激，記錄場(chǎng)景誘發(fā)僵直時(shí)間，主要反映海馬依賴性恐懼記憶；2h后放入改造后實(shí)驗(yàn)箱（白色分隔板遮住通電柵欄，改變四周箱壁顏色），自由探索3min后，給予上述相同聲音刺激3min，記錄線索誘發(fā)僵直時(shí)間，主要反映非海馬依賴性恐懼記憶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

4組小鼠術(shù)后3、7d NOR和FC結(jié)果比較 見(jiàn)表1。

4組小鼠術(shù)后3、7d的RI比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.14、4.462，均 P＜0.05）。術(shù)后 3 d，S 組、L 組和H組的 RI均低于 N 組（均 P＜0.05）；術(shù)后 7 d，L 組和 H組的RI均低于 N組（均 P＜0.01）。4組小鼠術(shù)后 3、7d的場(chǎng)景誘發(fā)僵直時(shí)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.28、10.45，均 P＜0.01）。S 組、L 組和 H 組術(shù)后 3、7d 的場(chǎng)景誘發(fā)僵直時(shí)間均低于N組（均P＜0.05），且H組低于L組（均P＜0.05）。4組小鼠術(shù)后3、7d的線索誘發(fā)僵直時(shí)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.73、11.7，均 P＜0.01）。S組、L組和H組術(shù)后3、7d的線索誘發(fā)僵直時(shí)間均低于N組（均P＜0.05），且H組均低于L組（均P＜0.05）。

表1 4組小鼠術(shù)后3、7d NOR和FC結(jié)果比較

3 討論

與傳統(tǒng)的開(kāi)放性手術(shù)相比，微創(chuàng)的腹腔鏡手術(shù)具有顯著的優(yōu)勢(shì)，包括減輕術(shù)后疼痛、縮短住院時(shí)間、降低病死率和快速康復(fù)。然而，腹腔鏡手術(shù)并非沒(méi)有內(nèi)在器官的生理紊亂，腹壁受氣腹正壓擴(kuò)張所致的機(jī)械性損傷會(huì)增加患者術(shù)中和術(shù)后的應(yīng)激反應(yīng)[6]。腹腔鏡檢查所需的正壓氣腹會(huì)顯著降低腹腔內(nèi)臟器的血流灌注，促使無(wú)氧代謝的形成，進(jìn)而導(dǎo)致乳酸酸中毒、氧化應(yīng)激和臟器功能的損傷[6-7]。Schietroma等[2]觀察了不同氣腹壓（12～14mmHg vs 6～8mmHg）下行腹腔鏡腎上腺切除術(shù)對(duì)外周炎癥指標(biāo)影響，發(fā)現(xiàn)高氣腹壓組術(shù)后白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6及CRP水平均顯著升高。上述證據(jù)提示，氣腹是腹腔鏡手術(shù)創(chuàng)傷的一部分，高氣腹壓力可造成臟器功能的損傷和系統(tǒng)性炎癥介質(zhì)的表達(dá)增加。基于此，本研究通過(guò)對(duì)老年小鼠行腹腔探查手術(shù)建立POCD動(dòng)物模型，與先前研究一致，腹腔探查手術(shù)會(huì)明顯損害老年小鼠的物體識(shí)別記憶、海馬依賴和非海馬依賴的恐懼記憶。在此模型基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步施加氣腹干預(yù)以模擬臨床上的腹腔鏡“大手術(shù)”，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H組小鼠的場(chǎng)景性恐懼記憶和線索性恐懼記憶損害均顯著高于L組。

外科手術(shù)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生巨大的創(chuàng)傷和應(yīng)激，炎癥介質(zhì)（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量、快速的釋放，引起局部炎癥的同時(shí)，也使構(gòu)筑血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍細(xì)胞激活[8-9]。這些細(xì)胞產(chǎn)生的擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)血腦屏障及腦組織產(chǎn)生損傷，使得外周炎癥因子能直接突破中樞炎癥反應(yīng)區(qū)域的血腦屏障防御進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并激活中樞的免疫相關(guān)細(xì)胞（如小膠質(zhì)細(xì)胞），釋放多種炎性介質(zhì)，在參與中樞炎癥的各組分間形成多組正反饋，進(jìn)一步放大炎癥信號(hào)，對(duì)中樞神經(jīng)元造成損傷[8-10]，最終導(dǎo)致記憶和認(rèn)知功能受損[11]。因此，筆者推測(cè)高壓氣腹通過(guò)促進(jìn)外周炎癥進(jìn)展和增加BBB通透性，進(jìn)而引起中樞炎癥反應(yīng)的形成和惡化手術(shù)麻醉引起的認(rèn)知功能減退。對(duì)此假設(shè)的進(jìn)一步驗(yàn)證是未來(lái)研究的一個(gè)重要方向。

本研究選擇了目前POCD研究領(lǐng)域使用較為廣泛的新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和條件性恐懼實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估小鼠的認(rèn)知功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3、7d時(shí)H組和L組之間的RI均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示高氣腹壓對(duì)小鼠的物體識(shí)別記憶并未造成進(jìn)一步的損傷，這與恐懼記憶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不一致。筆者認(rèn)為，POCD所損傷的認(rèn)知功能涉及多個(gè)方面，累及的相關(guān)腦區(qū)也存在差異性，臨床中通常使用多維度、多方面的評(píng)估量表來(lái)診斷POCD，因此動(dòng)物研究也應(yīng)該結(jié)合更多的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（如Morris水迷宮、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)）來(lái)綜合評(píng)估認(rèn)知功能。在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，高壓氣腹可能更大程度的損傷了恐懼記憶，而對(duì)物體識(shí)別記憶無(wú)顯著影響。

隨著選擇性肌松拮抗劑舒更葡糖鈉的上市，針對(duì)腹腔鏡手術(shù)是否應(yīng)該常規(guī)應(yīng)用深肌松技術(shù)的討論愈發(fā)激烈。近來(lái)大量臨床研究證實(shí)深肌松麻醉下使用低氣腹壓（8mmHg）即可滿足大部分腹腔鏡手術(shù)的操作視野[12]。然而，相關(guān)研究中的關(guān)注點(diǎn)更多集中于手術(shù)空間、手術(shù)視野、術(shù)后疼痛、快速康復(fù)等，尚未有研究將認(rèn)知功能評(píng)估作為低氣腹壓的優(yōu)勢(shì)指標(biāo)之一。然而事實(shí)上，隨著外科技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多高齡患者接受長(zhǎng)時(shí)間、大創(chuàng)傷的手術(shù)，此類患者是POCD的相對(duì)高發(fā)人群，雖然胡夢(mèng)瑩等[13]已有初步的探索性研究，但仍需大量針對(duì)低氣腹壓對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能影響的高質(zhì)量臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行深入的探討。

綜上所述，相比低氣腹壓，高氣腹壓力加劇手術(shù)麻醉所致的老齡小鼠恐懼記憶損害。