脊髓損傷恒河猴下肢殘留跨步能力的評(píng)估

趙璨，魏瑞晗，趙文，季潤(rùn)，饒家聲1,，楊朝陽(yáng)，李曉光,

1.北京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心，北京市 100083；2.北京航空航天大學(xué)儀器科學(xué)與光電工程學(xué)院測(cè)控與信息技術(shù)系，北京市 100083；3.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物材料與神經(jīng)再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市 100083；4.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京市 100069；5.國(guó)家康復(fù)輔具研究中心人體生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京市100176

脊髓損傷是中樞神經(jīng)損傷的一種，它會(huì)導(dǎo)致脊髓內(nèi)長(zhǎng)程傳導(dǎo)束的斷裂，從而引發(fā)運(yùn)動(dòng)功能部分或完全喪失。由于成年哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自發(fā)恢復(fù)能力極其貧乏[1]，因此脊髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)功能缺失往往是永久且不可逆轉(zhuǎn)的。

研究脊髓損傷最主要的指標(biāo)是殘留運(yùn)動(dòng)功能輸出的恢復(fù)，它能夠最直觀地反映脊髓損傷的受損程度或治療效果。其中，非人靈長(zhǎng)類脊髓損傷運(yùn)動(dòng)評(píng)估對(duì)于闡明脊髓傳入通路的完整性及腦-脊髓結(jié)構(gòu)的作用等方面具有重要意義。有研究通過(guò)對(duì)非人靈長(zhǎng)類在開放場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)評(píng)估脊髓損傷后的下肢/四肢運(yùn)動(dòng)輸出，從而評(píng)估細(xì)胞/介入治療方案的效果[2-3]。然而，這些研究依賴于觀察者的主觀評(píng)估，對(duì)運(yùn)動(dòng)輸出的變化不夠敏感和精確。最近的研究開始將雙足行走的動(dòng)物模型引入脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)評(píng)價(jià)中，通過(guò)分析雙足行走的足跡[4]、足底壓力[5]或雙足運(yùn)動(dòng)的步態(tài)[6-8]來(lái)反映動(dòng)物在脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能變化。其中，步態(tài)分析方法能夠通過(guò)大量參數(shù)獲得更為準(zhǔn)確、客觀的步態(tài)特征，進(jìn)而展現(xiàn)中樞神經(jīng)損傷對(duì)步態(tài)特征的影響，因此在脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)評(píng)估中具有顯著優(yōu)勢(shì)。

另一方面，步態(tài)分析在臨床研究中已被廣泛用于評(píng)估由神經(jīng)系統(tǒng)疾病所導(dǎo)致的步態(tài)異常或運(yùn)動(dòng)障礙，為分析步態(tài)異常的原因和制定治療/康復(fù)的方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[9]。基于此，從非人靈長(zhǎng)類雙足運(yùn)動(dòng)的評(píng)估中得到的步態(tài)數(shù)據(jù)在向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。

本研究采用步態(tài)分析方法縱向評(píng)估恒河猴在脊髓損傷前及損傷后6 周和12 周時(shí)的步態(tài)表現(xiàn)，獲取不同時(shí)間點(diǎn)的步態(tài)特征并進(jìn)行分析，探索脊髓部分損傷后非人靈長(zhǎng)類雙下肢運(yùn)動(dòng)功能隨時(shí)間的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性成年恒河猴4 只，體質(zhì)量(5±1)kg，年齡4～6歲，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)流程經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

1.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練范式

所有恒河猴在正式實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練3次，在跑步機(jī)上完成約束條件下的雙足跨步運(yùn)動(dòng)，每周1次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被保定于特制的固定裝置上，雙足站立于靜止的跑步機(jī)上，適應(yīng)10～20 min 之后開始跨步運(yùn)動(dòng)。訓(xùn)練過(guò)程采用正反饋機(jī)制讓動(dòng)物學(xué)習(xí)移動(dòng)雙下肢來(lái)完成行走。跑步機(jī)速度0.8 km/h。如果恒河猴能夠連續(xù)行走10 步以上就給予果汁獎(jiǎng)勵(lì)，連續(xù)完成10 次10步以上的跨步行走即可完成當(dāng)次訓(xùn)練。

1.3 脊髓損傷手術(shù)

恒河猴脊髓半側(cè)移除模型由專業(yè)外科醫(yī)生執(zhí)行，無(wú)菌環(huán)境下完成。術(shù)前肌肉注射鹽酸氯胺酮注射液10 mg/kg 誘導(dǎo)麻醉，隨后肌肉注射鹽酸塞拉嗪溶液5 mg/kg 維持麻醉，術(shù)中靜脈持續(xù)注射氯化鈉葡萄糖溶液40 滴/min。暴露胸椎T7-9節(jié)段，手術(shù)顯微鏡下切開硬脊膜暴露脊髓，以脊髓中央后靜脈作為脊髓中線標(biāo)志，在右半側(cè)切除脊髓組織1 cm，造成脊髓半側(cè)損傷。術(shù)后3～5 d 內(nèi)，動(dòng)物肌肉注射頭孢唑林30 mg/kg和丁丙諾啡0.15～0.3 mg/kg以預(yù)防感染。

恒河猴在標(biāo)準(zhǔn)猴籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，任意獲取新鮮蔬果、猴糧及干凈的水。所有動(dòng)物術(shù)后均被嚴(yán)格檢測(cè)，尤其是排尿、排便情況。飼養(yǎng)室內(nèi)保持溫度23～26 ℃、濕度35%～45%。

1.4 步態(tài)測(cè)試

分別在脊髓損傷前、脊髓損傷后6 周和12 周進(jìn)行步態(tài)測(cè)試。步態(tài)測(cè)試前，恒河猴以與訓(xùn)練期同樣的狀態(tài)被保定于固定裝置，隨后將熒光標(biāo)記點(diǎn)固定于雙側(cè)髂前上棘、髂后上嵴、大腿、膝關(guān)節(jié)、小腿、踝關(guān)節(jié)、足后跟、足趾，共16個(gè)點(diǎn)。其中，大腿標(biāo)記點(diǎn)的位置為大轉(zhuǎn)子到膝關(guān)節(jié)總長(zhǎng)度的上2/3 處，小腿標(biāo)記點(diǎn)的位置為膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)連線的中點(diǎn)，足趾標(biāo)記點(diǎn)的位置為足中指第二跖骨關(guān)節(jié)處，其余標(biāo)記點(diǎn)均貼于相應(yīng)骨性解剖位置。采用VICON 系統(tǒng)(Vicon 8,Oxford Metrics Limited,UK)采集下肢步態(tài)數(shù)據(jù)，采集頻率為100 Hz。測(cè)試中，動(dòng)物在速度0.8 km/h 跑步機(jī)上行走，連續(xù)行進(jìn)＞10步的數(shù)據(jù)被保留。

1.5 步態(tài)數(shù)據(jù)處理及分析

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行雙足行走時(shí)共有6 個(gè)紅外攝像機(jī)進(jìn)行拍攝，VICON 系統(tǒng)將所有攝像機(jī)傳回的2D 信號(hào)重新整合，構(gòu)建一個(gè)3D 空間并實(shí)時(shí)記錄每個(gè)熒光標(biāo)記點(diǎn)的3D 空間坐標(biāo)值。同時(shí)該系統(tǒng)能夠根據(jù)各個(gè)點(diǎn)的空間位置構(gòu)建恒河猴下肢的肢體及關(guān)節(jié)模型(圖1)以模擬動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)軌跡。根據(jù)采集到的所有熒光標(biāo)記點(diǎn)實(shí)時(shí)3D 坐標(biāo)值，計(jì)算步態(tài)參數(shù)，包括步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)、步長(zhǎng)、步高、膝/踝關(guān)節(jié)角度幅值等。

跨步是一個(gè)復(fù)雜的運(yùn)動(dòng)，肢體各節(jié)段、關(guān)節(jié)之間會(huì)互相影響，因此各步態(tài)參數(shù)之間也會(huì)相互影響?；诖?，將可能存在關(guān)聯(lián)影響的參數(shù)設(shè)為聯(lián)動(dòng)參數(shù)，即，步長(zhǎng)和步高視為一對(duì)聯(lián)動(dòng)參數(shù)，踝關(guān)節(jié)屈曲/伸展幅值和膝關(guān)節(jié)屈曲/伸展幅值視為一對(duì)聯(lián)動(dòng)參數(shù)。

與人類不同，恒河猴為趾行性動(dòng)物，即邁步時(shí)不是足跟落地而是足趾先觸地。因此，在本研究中恒河猴的一個(gè)完整的步態(tài)周期被定義為單側(cè)肢體一次足趾觸地到下一次足趾觸地的過(guò)程。而步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)即動(dòng)物在跨步過(guò)程中單側(cè)肢體從足趾離地到下一次足趾離地所用時(shí)長(zhǎng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 步態(tài)協(xié)調(diào)性

脊髓損傷前，所有動(dòng)物雙足均能完成連續(xù)跨步，同時(shí)雙足間跨步為交替進(jìn)行，協(xié)調(diào)性良好。單側(cè)肢體的整個(gè)步態(tài)周期可以進(jìn)一步細(xì)化為雙站立期-單站立期-雙站立期-擺動(dòng)期，與人類步態(tài)極大相似。同時(shí)每只動(dòng)物雙側(cè)肢體的各個(gè)步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)較為均勻，雙側(cè)步態(tài)穩(wěn)定。

脊髓損傷后6 周，患側(cè)均沒有觀察到明顯的擺動(dòng)期，肢體始終處于拖拽狀態(tài)，無(wú)法完成完整的跨步。同時(shí)，肢體間的協(xié)調(diào)性也受到極大影響，兩側(cè)肢體沒有觀察到任何交替步態(tài)，患側(cè)肢體是在健側(cè)肢體的帶動(dòng)下被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，而非主動(dòng)邁步。

脊髓損傷后12 周，患側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)功能仍然缺失，盡管有部分動(dòng)物能夠偶爾完成不連續(xù)跨步，但患側(cè)肢體仍然處于拖拽狀態(tài)，未觀察到明顯的擺動(dòng)期。但雙側(cè)協(xié)調(diào)性較脊髓損傷后6 周有輕微的恢復(fù)。見圖2。

脊髓損傷前，所有動(dòng)物的步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)為(1.51±0.07) s，其中站立期(0.89±0.07) s，擺動(dòng)期(0.62±0.03)s。脊髓損傷后6 周和12 周，步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)均顯著增加(P＜0.001)；6 周和12 周間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 關(guān)節(jié)角度變化

由于脊髓損傷后患側(cè)肢體始終未完成完整的步態(tài)，無(wú)法采集到足夠的步態(tài)參數(shù)來(lái)進(jìn)行分析，因此僅對(duì)健側(cè)肢體的步態(tài)進(jìn)行分析。

圖1 恒河猴脊髓損傷后健側(cè)下肢一個(gè)步態(tài)周期的3D棍棒模型

圖2 恒河猴脊髓損傷前后連續(xù)5個(gè)步態(tài)周期雙側(cè)下肢步態(tài)協(xié)調(diào)性

所有恒河猴在健康時(shí)期膝/踝關(guān)節(jié)均呈近似“w”的曲線分布，與人類步行膝踝關(guān)節(jié)屈曲/伸展變化類似。最大膝/踝關(guān)節(jié)伸展均出現(xiàn)在擺動(dòng)期末尾，第二個(gè)波峰出現(xiàn)在擺動(dòng)期起始，而最大膝/踝關(guān)節(jié)屈曲則出現(xiàn)在擺動(dòng)期中期，且在站立期中期膝關(guān)節(jié)屈曲/伸展曲線中能觀察到明顯的平臺(tái)期。但與人類相比，由于恒河猴的雙足運(yùn)動(dòng)呈屈膝屈髖模式，因此其屈曲伸展的幅值較人類更小。脊髓損傷后，恒河猴下肢膝/踝關(guān)節(jié)整體的屈曲/伸展模式未發(fā)生改變，仍然呈類似“w”的曲線分布，但其在擺動(dòng)期內(nèi)的曲線變化更為陡峭，波峰波谷更明顯，且整體的變化幅值偏大。見圖3。

表1 不同時(shí)間恒河猴步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)比較(s)

脊髓損傷6 周和12 周，健側(cè)一個(gè)完整的步態(tài)周期內(nèi)踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的屈曲/伸展幅值均顯著增加(P＜0.001)，兩時(shí)間點(diǎn)間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 步態(tài)參數(shù)聯(lián)動(dòng)變化

脊髓損傷前后恒河猴健側(cè)步長(zhǎng)/步高、膝關(guān)節(jié)角度變化幅值/踝關(guān)節(jié)角度變化幅值均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。但聯(lián)動(dòng)參數(shù)在脊髓損傷后6 周的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性明顯弱于損傷前，損傷后12周其數(shù)據(jù)穩(wěn)定性有一定程度的恢復(fù)。見表3。

2.4 步態(tài)參數(shù)相關(guān)性

左側(cè)步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)與步長(zhǎng)(r=0.838,P=0.001)、步高(r=0.726,P=0.007)和踝關(guān)節(jié)角度變化幅值(r=0.766,P=0.004)均呈正相關(guān)，踝關(guān)節(jié)角度變化幅值與步長(zhǎng)呈正相關(guān)(r=0.627,P=0.029)。膝關(guān)節(jié)角度變化幅值與其他步態(tài)參數(shù)不相關(guān)(P＞0.05)。

表2 脊髓損傷前后恒河猴健側(cè)踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的屈曲/伸展幅值比較(°)

表3 脊髓損傷前后健側(cè)恒河猴步態(tài)參數(shù)聯(lián)動(dòng)變化

圖3 恒河猴健側(cè)肢體脊髓損傷前后膝/踝關(guān)節(jié)角度幅值變化

3 討論

已有眾多關(guān)于嚙齒類動(dòng)物的研究探索脊髓損傷與運(yùn)動(dòng)功能之間的關(guān)系以及損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的進(jìn)程[10-12]，這些研究為脊髓損傷的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，對(duì)于嚙齒類動(dòng)物來(lái)說(shuō)，即便是嚴(yán)重的脊髓損傷，其運(yùn)動(dòng)功能的高自發(fā)恢復(fù)率也可能會(huì)過(guò)度預(yù)測(cè)殘留/新生白質(zhì)對(duì)運(yùn)動(dòng)輸出的貢獻(xiàn)[2]。尤其是將相關(guān)研究的結(jié)論轉(zhuǎn)化至非人靈長(zhǎng)類或人類研究時(shí)，其可靠性和安全性均受到一定的制約。

近年來(lái)有大量健康非人靈長(zhǎng)類運(yùn)動(dòng)分析的研究。Goetz 等[13]展示了限制條件下健康非人靈長(zhǎng)類雙下肢行走的步態(tài)模式與人類類似，由連續(xù)交替的站立期(單站立期和雙站立期)和擺動(dòng)期構(gòu)成。本研究4 只恒河猴在脊髓半側(cè)移除術(shù)前也都觀察到完全一致的步態(tài)模式。脊髓損傷后，患側(cè)肢體均無(wú)法完成跨步，這是由半側(cè)皮質(zhì)脊髓束輸出中斷造成的。健側(cè)肢體雖然能夠完成連續(xù)步態(tài)，但與脊髓損傷前相比，膝/踝關(guān)節(jié)屈曲伸展的幅值在擺動(dòng)期內(nèi)顯著增加，提示脊髓損傷后恒河猴能夠通過(guò)增加膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)的屈曲伸展幅度來(lái)完成步態(tài)周期。健側(cè)肢體在脊髓損傷后采用這樣的跨步策略，可彌補(bǔ)患側(cè)肢體承重能力和擺動(dòng)缺失所帶來(lái)的負(fù)面影響。還有研究顯示[14-15]，當(dāng)跑步機(jī)速度增加時(shí)，健康恒河猴的雙足運(yùn)動(dòng)并不會(huì)通過(guò)增加步頻來(lái)適應(yīng)更高的速度，而是在擺動(dòng)期時(shí)長(zhǎng)保持穩(wěn)定的同時(shí)，以膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)屈伸幅度的增加完成更高速的步行，而保持基本恒定的步頻。本研究中，在速度不變的情況下，脊髓損傷后恒河猴的健側(cè)肢體同樣在保持?jǐn)[動(dòng)期基本不變的情況下，擺動(dòng)期內(nèi)膝/踝關(guān)節(jié)的屈曲伸展幅值增加，從而步頻降低。提示脊髓損傷后動(dòng)物的健側(cè)肢體在跑步機(jī)上展現(xiàn)出的“步態(tài)策略”與健康動(dòng)物在高速跑步機(jī)上所采用的策略一致。通過(guò)這種“步態(tài)策略”，動(dòng)物能夠獲得更為有效的步伐，從而補(bǔ)償患側(cè)下肢運(yùn)動(dòng)功能的不足。

雖然脊髓損傷會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的步態(tài)策略發(fā)生改變，但關(guān)聯(lián)參數(shù)如步長(zhǎng)/步高或膝/踝關(guān)節(jié)屈曲伸展幅值之間的協(xié)變性(如變化的程度和趨勢(shì))顯示高度的穩(wěn)定性。提示健側(cè)肢體的各個(gè)部分(大腿、小腿、足及各個(gè)關(guān)節(jié)等)之間的內(nèi)在耦合并沒有受到損傷的影響，這可能也是健側(cè)下肢在脊髓損傷后仍然能夠維持跨步能力的根本原因。這意味著脊髓損傷后，健側(cè)下肢的上層運(yùn)動(dòng)控制(腦)并沒有受損，并及時(shí)根據(jù)肢體運(yùn)動(dòng)缺失的情況代償性調(diào)整運(yùn)動(dòng)策略，以維持殘留的運(yùn)動(dòng)能力。

有研究報(bào)道[17]，雙足運(yùn)動(dòng)獼猴隨著跑步機(jī)速度增加而單調(diào)增加跨步長(zhǎng)度和頻率。Ogihara等[18]發(fā)現(xiàn)，周期時(shí)長(zhǎng)隨速度的增加而減少，跨步長(zhǎng)度增加。本研究中，跑步機(jī)速度恒定時(shí)，步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)和步長(zhǎng)、步高和踝關(guān)節(jié)角度幅值呈正相關(guān)。提示步態(tài)周期時(shí)長(zhǎng)可能是脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)學(xué)分析中的一個(gè)關(guān)鍵性參數(shù)。

此外，脊髓損傷后12周，健側(cè)肢體的參數(shù)趨于穩(wěn)定。同時(shí)，在脊髓損傷后6 周不能完成任何跨步運(yùn)動(dòng)的患側(cè)在12周時(shí)也能觀察到偶發(fā)的不完整步態(tài)。這與之前的研究結(jié)果[19]相結(jié)合，意味著脊髓損傷導(dǎo)致的一系列病理進(jìn)程(變化/事件)在12周趨于穩(wěn)定，甚至有一定程度的恢復(fù)。運(yùn)動(dòng)通路內(nèi)在的可塑性或殘留白質(zhì)的軸突出芽，新的神經(jīng)回路的形成[20-21]，脊髓結(jié)構(gòu)之間的連接重組[22]等事件可能均為這一現(xiàn)象做出貢獻(xiàn)。然而，潛在的神經(jīng)生理機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

本研究還存在一定的局限性。首先，不同于臨床美國(guó)脊髓損傷協(xié)會(huì)評(píng)分及大鼠BBB評(píng)分，步態(tài)運(yùn)動(dòng)學(xué)分析對(duì)受試對(duì)象的身體狀況有一定要求，因此完全損傷或超急性期內(nèi)的受試對(duì)象，以及有其他外傷影響運(yùn)動(dòng)的受試對(duì)象可能無(wú)法完成測(cè)試。其次，本研究只選取損傷后6 周和12 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)學(xué)測(cè)試及分析，12周之后由脊髓損傷誘發(fā)的功能可塑性和運(yùn)動(dòng)恢復(fù)可能仍在進(jìn)行之中，因此需要更為全面且更長(zhǎng)時(shí)程的研究。最后，本研究使用的是T7-9節(jié)段半側(cè)切除的恒河猴模型，未來(lái)應(yīng)選取更為接近臨床的挫傷模型或介入治療模型進(jìn)一步研究。