電針對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力及前額葉P35/P25-周期蛋白依賴性激酶5-Tau蛋白磷酸化通路的影響

王依瀅，唐成林，邱國平，徐進，隆令，許毅，王健蓉，甘勝偉，盛華均，朱淑娟

1.重慶醫科大學，a.人體解剖教研室；b.中醫藥學院，重慶市 400016；2.成都大學醫學院，四川成都市 610106；3.成都市第五人民醫院神經內科，四川成都市611130

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性記憶力減退為主要臨床表現的神經系統退行性疾病，β 淀粉樣蛋白(amyloid β,Aβ)沉積形成的老年斑和Tau 過度磷酸化導致的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)是其主要病理特征[1]。眾多學者對AD 的研究普遍集中于海馬這一與學習記憶密切相關的腦區[2]，但忽視了另一嚴重影響患者的癥狀，即以冷漠、抑郁和易激怒為主的精神行為癥狀(behavioral and psychological symptoms of dementia,BPSD)[3]。Huey 等[4]分析57 例AD 患者，發現腹內側前額葉皮質(ventromedial prefrontal cortex,vPFC)與冷漠獨立相關。大腦額葉在認知過程中也發揮重要作用，其中注意力、工作記憶、決策是與前額葉皮質(prefrontal cortex,PFC)相關的常見認知功能[5]。PFC 病變可能同時與認知功能損傷和BPSD 密切相關，成為AD 發病機制研究的另一重點區域。

目前，對AD 的治療并不理想。電針能有效改善AD 模型學習記憶能力，降低Aβ 沉積，并減少Tau 蛋白的過度磷酸化[6-8]。周期蛋白依賴性激酶5 (cyclindependent kinase 5,CDK5)及其調節因子P35/P25 在Tau 蛋白的過度磷酸化過程中具有重要作用。Aβ 的神經毒性會破壞神經元的鈣穩態，從而導致鈣蛋白酶激活，并將P35 裂解為P25 和P10；CDK5 與其調節因子P35 或P25 結合后才具有生物活性。據報道[9-11]，P35和CDK5 結合形成的復合物具有神經保護作用，而P25激活CDK5的功能更強，可能導致Tau蛋白的過度磷酸化。

本研究觀察電針百會、腎俞兩穴對AD 模型大鼠PFC P35/P25-CDK5-Tau 蛋白磷酸化信號通路相關蛋白表達的影響，為電針治療AD 的臨床應用提供更多的實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性成年Sprague-Dawley大鼠30只，體質量240～280 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(渝)2018-0003。分籠飼養于恒溫恒濕環境中，自由進食攝水。隨機數字表法分為正常對照組、假手術組、模型組和電針組，每組6 只，剩余6只備用，并用苦味酸標記。所有實驗操作均嚴格遵循動物福利與倫理準則相關要求。

1.2 主要儀器和試劑

針灸針(直徑0.18 mm、長25 mm)：北京中研太和醫療器械有限公司。6805-AⅡ電針儀：汕頭市醫用設備廠有限公司。大鼠立體定位儀、Morris 水迷宮：美國瑞沃德公司。Legend Micro 17R 低溫離心機、1510酶標儀：賽默飛世爾公司。37 ℃恒溫水浴箱：上海智城分析儀器制造有限公司。凝膠成像儀、蛋白電泳儀：BIO-RAD 公司。DM2000 光學顯微鏡、RM 2235ccwUS石蠟切片機：德國LEICA公司。

Aβ25-35(A4559)：SIGMA 公司。CDK5 兔單克隆抗體(ab400773)、Tau[pS199]兔單克隆抗體(ab81268)、Tau[pS202]兔單克隆抗體(ab108387)、Tau5 鼠單克隆抗 體(ab80579)：ABCAM 公司。P35/P25 兔單克隆抗體(2680)：CST 公司。β-actin 兔單克隆抗體(20536-1-AP)：PROTEINTECH 公司。HRP AffiniPure 山羊抗兔IgG (H+L) (E030120-01)、HRP AffiniPure 山羊抗鼠IgG (H+L) (E030110)：EARTHOX LIFE SCIENCE 公司。RIPA (P0013C)、PMSF (ST506)、一抗稀釋液(P0023A)、封閉液(P0023B)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)：碧云天生物科技有限公司。Western blotting 配膠試劑盒(CW0022M)：北京康為世紀生物科技有限公司。ECL發光液(4AW011)：北京四正柏生物科技有限公司。SABC 免疫組化試劑盒(SA1050)：博士德生物工程有限公司。DAB 試劑盒(ZLI-9018)：北京中杉金橋生物技術有限公司。蘇木素染色液(G1080)：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 AD模型建立

將Aβ25-35用無菌生理鹽水稀釋成1 g/L 的溶液，37 ℃水浴1 周。3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，根據大鼠腦立體定位圖譜選擇雙側海馬區域(前囟后4 mm，中線左右各旁開2.9 mm，深度4.1 mm)，每側用微量注射器1 μl/min 注入Aβ25-3510 μl，留針10～15 min，1.0 mm/min 緩慢出針。牙托粉封固顱骨孔并縫合皮膚。每天肌肉注射青霉素G 10 萬U，共3 d。假手術組雙側海馬注射等量生理鹽水。正常對照組不做處理。術后各組大鼠常規飼養。

1.4 電針治療

造模后第2 天，根據大鼠穴位定位圖譜，針刺電針組百會(頂骨正中部位)、腎俞(第2腰椎下旁開7 mm左右)。百會向前平刺3～5 mm，腎俞稍向內斜刺5 mm，連接電針儀，頻率2 Hz，電流2 mA，刺激15 min，每天1 次，共10 d。其余大鼠均只抓取不電針。由固定人員在固定時間操作。

1.5 Morris水迷宮

治療結束后次日進行Morris水迷宮實驗。

可視平臺實驗：第1～2 天，將水池均分為4 個象限，平臺位于第3 象限且高出水面約1 cm，將大鼠按照編號依次從4 個象限放入，每個象限各1 次且每只大鼠每次間隔30 min。單次尋找平臺時間為1 min，找到平臺則停止，若未找到則引導其至平臺并學習10 s。記錄大鼠找到平臺時間(逃避潛伏期)以及其搜索路徑。

隱蔽平臺實驗：第3～6 天，將平臺置于水面下約0.5 cm處，余同可視平臺實驗。

空間探索實驗：第7 天，撤掉平臺，將大鼠依次從4 個象限放入，記錄1 min 內穿越原有平臺位置的次數。

1.6 組織樣本取材

Morris 水迷宮實驗后，大鼠過量3%戊巴比妥鈉腹腔注射，心尖灌注0.9%氯化鈉溶液約200 ml，冰上取腦，左側PFC 組織用于提取蛋白，右側4%多聚甲醛固定24～48 h 后，蔗糖梯度脫水，石蠟包埋。連續冠狀切片，厚4 μm，室溫保存。

1.7 檢測方法

1.7.1免疫組織化學染色

切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，95 ℃下0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復，洗片，3%H2O2室溫孵育，5% BSA 37 ℃封閉30 min，分別滴加P35/P25(1∶100)、CDK5(1∶100)、Tau5(1∶100)一抗4 ℃過夜。37 ℃復溫40 min，加入相應二抗孵育60 min，洗片；滴加SABC 37 ℃孵育30 min，DAB 染色，蘇木素常溫染核30 s，光學顯微鏡下觀察顏色并適時終止，雙蒸水洗片，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，普通光學顯微鏡下采圖，Image J測量平均光密度(optical density,OD)。

1.7.2Western blotting

提取蛋白后，按40 μg 總蛋白進行上樣，80 V恒壓電泳，截取目的和內參條帶，250 mA恒流電轉1 h。將含有目的和內參蛋白的PVDF膜放入封閉液中37 ℃孵育2 h，分別置于β-actin (1∶5000)、P35/P25 (1∶1000)、CDK5 (1∶2000)、Tau[pS199](1∶10000)、Tau[pS202](1∶10000)、Tau5 (1∶1000)一抗溶 液中4 ℃孵育過夜。PBST 常溫洗膜，加入相應二抗(1∶10000)，37 ℃孵育1 h，PBST 清洗，ECL 顯色，凝膠成像系統進行采圖，Quantity One 軟件分析各條帶灰度值，計算目的蛋白與β-actin 灰度比，作為相對表達量。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

與正常對照組和假手術組比較，模型組行動緩慢、反應遲鈍、食欲下降、毛發干燥。而電針組行動、飲食和毛發情況等較模型組有明顯好轉。

2.2 水迷宮測試

可視平臺實驗中，各組逃避潛伏期和搜索路徑均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

隱蔽平臺實驗中，與正常對照組和假手術組比較，模型組逃避潛伏期和搜索路徑延長(P＜0.05)；與模型組比較，電針組縮短(P＜0.05)。見表2、表3。

空間探索實驗中，與正常對照組和假手術組比較，模型組穿越平臺次數減少(P＜0.05)；與模型組比較，電針組穿越平臺次數增加(P＜0.05)。見表4。

2.3 免疫組織化學染色

各組均有P35/P25、CDK5、Tau5 黃棕色陽性表達，且集中表達于細胞質中。模型組P35/P25 和CDK5 陽性表達明顯高于正常對照組和假手術組(P＜0.01)；電針組顯著低于模型組(P＜0.001)。見圖1、表5。

2.4 Western blotting

模型組Tau[pS199]、Tau[pS202]、CDK5、P35/P25 的相對表達高于正常組和假手術組(P＜0.05)，電針組低于模型組(P＜0.05)。見圖2、表6。

表1 可視平臺實驗中各組逃避潛伏期和搜索路徑比較

表2 隱蔽平臺實驗中各組逃避潛伏期比較(s)

表3 隱蔽平臺實驗中各組大鼠搜索路徑的比較(cm)

表4 空間探索實驗中各組穿越平臺次數比較

表5 各組PFC腦區P35/P25、CDK5、Tau5的表達(OD)

表6 各組PFC組織Tau5、Tau[pS199]、Tau[pS202]、CDK5、P35和P25蛋白相對表達量比較(Western blotting)

圖1 各組PFC腦區P35/P25、CDK5、Tau5的表達(免疫組織化學染色，bar=50 μm)

圖2 各組PFC組織Tau5、Tau[pS199]、Tau[pS202]、CDK5、P35/P25蛋白表達量比較

3 討論

既往對AD 發病機制和治療的研究主要集中在海馬區域。海馬與顳葉、頂葉、前扣帶回、基底節區等部位均有密切聯系[12-14]；之前被忽視的與工作記憶、社會認知、情緒等密切相關的PFC 近年亦逐漸進入研究者們的視野[15]。李傳明等[16]通過功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging,fMRI)等方法對AD 患者和健康老年人PFC 注意功能區進行檢測與對比，結果顯示AD 患者雙側背外側PFC (dorsolateral prefrontal cortex,DLPFC)和vPFC 激活體積明顯小于正常組，提示AD患者的PFC存在一定程度的功能障礙。本研究選擇海馬注射Aβ25-35的方法建造AD 模型，觀察PFC P35/25、CDK5 及一些位點磷酸化的Tau 蛋白的表達變化，從Tau 蛋白的磷酸化路徑探究電針對AD的治療機制。

Aβ 沉積和Tau 蛋白過度磷酸化是AD 最主要的病理特征。許多研究發現二者間可能存在著聯系，共同導致AD 的發生[17-18]。Tau 蛋白的磷酸化程度主要取決于蛋白激酶和磷酸酶的平衡。CDK5 作為重要的激酶之一，是突觸發生與傳遞、神經元遷移、細胞存活的關鍵調節因子[19]，過度激活可能引起神經退行性變等一系列病理改變[20]。P35 是一個相對分子質量為35×103的蛋白，在興奮性毒性、氧化應激等作用下，能夠被鈣蛋白酶分解為半衰期更長且激活CDK5 能力更強 的P25[21-22]。Patrick 等[11]發現，P25/CDK5 復合物能夠使Tau 蛋白過度磷酸化，從而降低Tau 蛋白與微管結合的能力；并在原代神經元中證明P25/CDK5 復合物的表達可誘導細胞骨架破壞、形態退化和凋亡。因此，P35/P25與CDK5的復合物可能與Tau蛋白磷酸化密切相關。

本研究顯示，模型組PFC 組織中的P35/P25、CDK5，以及Ser199 和Ser202 位點上的磷酸化Tau 蛋白表達增加，可能是Aβ的毒性作用影響細胞內Ca2+濃度，促進P35 生成增多，并裂解形成的P25 亦增多，與CDK5 形成復合物，導致Tau 蛋白在Ser199 和Ser202 位點上的磷酸化程度增加。Shi 等[23]發現，經Aβ25-35處理后的神經元中P35 明顯減少，與本研究不符，這可能是由于離體和在體實驗中組織細胞生存環境的差異所致。還有報道顯示，AD患者腦組織中P25含量并未增加[24]，在AD早期P25表達甚至減少[25]。模型選擇、樣本來源、病程階段以及實驗方法的差異等都可能引起這些矛盾的結果。

目前，許多學者希望通過單一制劑對AD 發病機制中的某些相關因子進行調控，如CDK5 抑制劑，并設想其能抑制CDK5 活性或干擾P25 與CDK5 復合物的形成，從而達到延緩AD 的發生發展的功效，但它可能同時影響CDK 家族的其他成員，導致嚴重副作用的發生[26]。針灸(電針)可能通過改善線粒體超微結構[27]、提高突觸密度[28]、抑制細胞凋亡，保護神經細胞[29-30]、減輕腦內自由基對神經元的損傷[31]、改善炎性反應[32]，維持AD 模型鼠的學習記憶能力。本研究顯示，電針百會和腎俞減少AD 模型鼠PFC P35/P25和CDK5 的表達，減緩Ser199 和Ser202 位點上Tau 蛋白的磷酸化?？梢姡樉?電針)對AD 模型鼠的干預機制可能涉及多個方面。

綜上所述，大鼠海馬注射Aβ25-35后，能激活PFC P35/P25-CDK5-Tau 蛋白磷酸化信號通路，誘發Tau 蛋白過度磷酸化；電針可抑制PFC P35/P25-CDK5-Tau蛋白磷酸化信號通路，從而抑制Tau 蛋白過度磷酸化從而延緩NFTs的形成。但Tau蛋白其他位點的變化情況及細胞內Ca2+濃度的改變有待進一步探討。另外，電針如何調節眾多信號物質變化的關鍵步驟等也值得進一步研究。