雙斑長跗螢葉甲成蟲糞便活性成分鑒定

李 倫，楊 陳，陳 靜

(石河子大學農學院 / 新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】雙斑長跗螢葉甲Monoleptahieroglyphica(Motschulsky) 屬于鞘翅目Coleoptera，葉甲科Chrysomelidae，分布于我國大部分地區，主要為害玉米和棉花等多種作物[1,2]。該葉甲成蟲取食寄主植物的葉表皮及葉肉，易形成花葉以及對葉片造成孔洞，進而對棉花的生產造成嚴重影響[3]。近年來，雙斑長跗螢葉甲對新疆地區的棉花等作物的危害日益嚴重，已逐漸成為部分區域棉花等作物上的主要害蟲[4]。長期使用化學藥劑已使該葉甲產生抗藥性，且污染環境[5]。尋找有效的防治方法，對利用活性化合物防治葉甲有實際意義。【前人研究進展】昆蟲信息化學物質是用來影響和控制同種昆蟲不同個體之間聚集、防御等多種行為的化合物，其中昆蟲聚集信息素(aggregation pheromone)，一般產生于昆蟲個體且通過其排泄物釋放，能夠引起雌雄兩性同種昆蟲的聚集行為[6]。鞘翅目昆蟲聚集信息素的來源，一昆蟲雌性體表揮發物[7]，二是昆蟲糞便揮發物[8]，三是昆蟲危害誘導出的植物揮發物[9]。聚集信息素成分復雜，已鑒定出的鞘翅目昆蟲聚集信息素的主要成分為一些烴、醇、醛、酮、酯、酸類化合物，同一個科的昆蟲聚集信息素化學結構相差不是很大，且多數昆蟲同屬的聚集信息素組分極為相似[6,10]。同一性別的蠹蟲所分泌的信息素往往包括三、四個甚至更多化合物的混合物[11]。長小蠹Platypus聚集信息素的化學成分主要是烯醇類[12]。十字花科跳甲Phyllotretacruciferae聚集信息素由多種萜烯類化合物組成的[13]。目前，昆蟲聚集信息素主要應用于害蟲誘殺和蟲情監測等方面[14,15]。例如,從華山松木蠹象Pissodespunctatus的新鮮蟲糞和雄蟲后腸中發現的聚集信息素活性成分對華山松木蠹象表現出一定的引誘作用[16]。澤桑梓等[17]通過GC-MS分離鑒定出1-甲基-2-異丙烯基-環丁烷乙醇在林間引誘試驗中對華山松木蠹象有較好的效果；范麗華等[18]也通過GC-MS分離鑒定出十八烷、十九烷、十二酸和十四酸對臍腹小蠢Scolytusschevyrewi有引誘性，并推斷其為臍腹小蠢聚集信息素的主要成分。利用昆蟲聚集信息素對該葉甲進行防治，是實現害蟲可持續控制的一種新的有效防治途徑。【本研究切入點】從雙斑長跗螢葉甲為害玉米和棉花后誘導出的揮發物中，雌、雄蟲對α-長葉蒎烯、3-蒈烯、γ-萜品烯、β-紫羅酮以及月桂烯等的EAG反應效果較好；行為反應表明，γ-萜品烯對雄蟲具有一定的引誘效果，β-紫羅酮對雌蟲具有一定的引誘效果[19,20]。由于昆蟲聚集信息素來源多樣化[21,22]。昆蟲糞便揮發物中的一些成分可能對昆蟲的聚集和趨避行為起著重要作用[23]，已知非洲飛蝗(Locustamigratoria)蝗蝻的糞便中含有群居信息素[24]。石旺鵬等[25]對東亞飛蝗的研究表明，該蟲活性較高的聚集信息素來源于其糞便中。雙斑長跗螢葉甲成蟲在棉田呈聚集型分布[26]，是否與其糞便揮發物起到一定的聚集作用，尚未報道。研究鑒定雙斑長跗螢葉甲成蟲糞便活性成分。【擬解決的關鍵問題】研究通過GC-MS采集鑒定雙斑長跗螢葉甲糞便揮發性化合物的組分和含量，利用觸角電位儀和“Y”型嗅覺儀測定雙斑長跗螢葉甲雌、雄成蟲對其糞便揮發物的電生理和行為反應，篩選出雙斑長跗螢糞便揮發物中對該葉甲具有聚集趨性的活性化合物，為研究該葉甲的聚集信息素奠定基礎，為利用活性化合物對該葉甲進行綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試昆蟲

雙斑長跗螢葉甲成蟲采自石河子大學農學院試驗站棉花田及周邊雜草，在特定的養蟲裝置內用棉花葉片飼養該蟲，將其放入PXZ型智能培養箱，光照周期設置為 L∶ D = 16∶ 8，溫度為(26 ± 1)℃，備用。

1.1.2 供試儀器

氣相色譜-質譜聯用儀GCMS-7890A-5975C(安捷倫，美國)；觸角電位儀(Syntech，荷蘭) ；“Y”型嗅覺儀(主管長15 cm，兩臂10 cm，內徑均為0.7 cm，兩測試臂夾角60°)。

1.2 方 法

1.2.1 雙斑長跗螢葉甲糞便揮發物組成的測定

在特制的養蟲裝置中放入30只健康的雙斑長跗螢葉甲成蟲，并在底部墊濾紙和新鮮的棉花葉片，之后將裝置放入培養箱中，24 h后收集新鮮糞便，除雜后將糞便收集在10 mL離心管中，將其密封、稱重、記錄，然后保存在4℃的冰箱中。試驗參照張增強[27]的方法，采用固相微萃取法采集雙斑長跗螢葉甲糞便揮發物：稱取6 g供試糞便，放入10 mL的萃取瓶中塞緊，在50℃的水浴鍋中加熱15 min，將100 μm的萃取纖維頭(PDMS)裝入萃取手柄內活化30 min，之后將其插入萃取瓶內萃取50 min，取樣完畢后放入290℃氣化室脫附10 min。通過氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術對采集到的雙斑長跗螢葉甲糞便揮發物進行定性分析，色譜柱是PE-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，氦氣作為載氣，流速為1 mL/se；使用手動固相微萃取進樣器(SPME)，進樣口溫度為250℃；升溫程序是：起始柱溫50℃，保持3 min，再以3℃/min 升溫至200℃，5℃/min升溫至280℃保持30 min。質譜條件為：電離源為EI，離子源溫度為230℃, GC-MS傳輸線溫度為200℃，質量掃描范圍為35～600 amu，EI電離能量為70 eV。檢索普庫為Nist 2008版。

1.2.2 觸角電生理反應

測定步驟參照劉航等[28]的方法，用眼科手術剪刀將雙斑長跗螢葉甲成蟲觸角從根部剪下，再除去觸角尖端1 mm，將剪好的觸角兩端搭在探頭兩端用導電膠固定。滴加10 μL糞便揮發物在濾紙條(35 mm×5 mm)上，將其放入1 mL的槍頭中連接混合出氣管且距離觸角1 cm，連續刺激氣體流量為500 mL/min，每次刺激1 s，間隔60 s進行下1次刺激。每個測試樣6次重復，在測試開始和結束時，用石蠟各測試1次作為對照，以校正樣品EAG值。

1.2.3 嗅覺行為反應

測定步驟參照張志虎等[29]方法，試驗選擇在較暗的室內進行，溫度為(25±1)℃，測試時在裝置上方安置2盞40 W的臺燈。裝置兩臂用Teflon管連接氣味源裝置、流量計、加濕器、活性炭過濾器、大氣采樣儀。氣體流速設為500 mL/min。供試昆蟲采用饑餓處理12 h的雌、雄雙斑長跗螢葉甲成蟲，當葉甲越過主管長度1/2處，開始計時并觀察其選擇性。當該葉甲越過1/3測定臂，記為做出選擇；若3 min后無選擇趨向，記為無選擇。每頭葉甲測1次，每測5頭成蟲后將兩臂互換位置，以消除誤差。雌、雄蟲一組各測試20頭，重復4次，共80頭。完成后用95%乙醇清洗裝置，晾干待用。

1.3 數據處理

利用SPSS 20.0進行方差分析和Duncan多重比較，雌、雄蟲對同一揮發物EAG反應值的差異顯著性采用獨立樣本t檢驗進行檢測。

嗅覺行為反應數據采用χ2檢驗雙斑長跗螢葉甲成蟲在2個氣味源間的選擇結果是否呈假設40∶40的理論分布，并且計算χ2值和相應的顯著性水平P值。

2 結果與分析

2.1 雙斑長跗螢葉甲成蟲糞便揮發物化學成分

研究表明，從雙斑長跗螢葉甲成蟲糞便的揮發物中檢測出29種化合物，其中揮發性成分以酯類化合物居多，約占69.28%；酮類、酚類和醛類化合物所占比例較少；烯類化合物中(Z)-γ-紅沒藥烯、α-石竹烯和α-蒎烯等含量較多；醇類化合物中1-十四烷醇、1-十七烷醇和α-紅沒藥醇為主要成分；烷類化合物中十八烷和十九烷居多；酸類化合物為壬酸和棕櫚酸且含量較少。單一化合物中總含量最高的為己二酸二辛酯，占總含量的55.30%，其次為鄰苯二甲酸-2-戊酯丁酯占總含量的7.04%。表1

2.2 雙斑長跗螢葉甲雌、雄成蟲對4種糞便揮發物的電生理反應

研究表明，從29種化合物中選取α-蒎烯、α-紅沒藥醇、α-石竹烯、棕櫚酸來測定雌、雄雙斑長跗螢葉甲成蟲對這4種揮發物的10、1、10-1和10-2μL/mL 4個濃度的EAG反應。表2

2.2.1 雙斑長跗螢葉甲雄成蟲對4種揮發物的EAG反應

雙斑長跗螢葉甲雄蟲對10、1、10-1和10-2μL/mL 4個濃度的α-蒎烯，10 μL/mL濃度的α-紅沒藥醇，10和1 μL/mL 2個濃度的α-石竹烯EAG反應效果較為明顯，對10、1、10-2μL/mL 3個濃度的棕櫚酸，10-2μL/mL的α-紅沒藥醇反應值相對較小。在4種揮發物中，雙斑長跗螢葉甲雄蟲對10 μL/mL的α-紅沒藥醇反應值最大，對α-紅沒藥醇和α-蒎烯的反應值隨揮發物濃度的增加而增大，對α-石竹烯的反應值隨揮發物濃度的增加先減小后增大。

2.2.2 雙斑長跗螢葉甲雌成蟲對4種揮發物的EAG反應

雙斑長跗螢葉甲雌蟲對10、1和10-2μL/mL 3個濃度的α-蒎烯，10、1和10-1μL/mL 3個濃度的α-紅沒藥醇，10、1和10-2μL/mL 3個濃度的α-石竹烯EAG反應效果較為明顯，對10和1 μL/mL 2個濃度的棕櫚酸，10-1μL/mL的α-石竹烯反應值相對較小。在4種揮發物中，雙斑長跗螢葉甲雌蟲對10 μL/mL的α-紅沒藥醇反應值最大，對α-紅沒藥醇的反應值隨揮發物濃度的增加而增大，對α-蒎烯和α-石竹烯的反應值隨揮發物濃度的增加先減小后增大。

2.3 雙斑長跗螢葉甲雌、雄成蟲對4種糞便揮發物的嗅覺行為反應

根據EAG反應的結果，選取10 μL/mL的α-蒎烯、α-紅沒藥醇、α-石竹烯和10-1μL/mL棕櫚酸與對照液體石蠟進行行為反應測定。圖1，圖2

2.3.1 雙斑長跗螢葉甲雄蟲對4種揮發物的嗅覺行為反應

研究表明,在4種揮發物中，雄雙斑長跗螢葉甲成蟲對4種揮發物的偏好性從強到弱依次為α-紅沒藥醇(χ2= 7.54，P<0.01，n = 80)>α-蒎烯(χ2= 5.69，P<0.05，n = 80)>棕櫚酸(χ2= 0.17，P>0.05，n = 80)>α-石竹烯(χ2= 0.43，P>0.05，n = 80)，其中α-紅沒藥醇和α-蒎烯對雄蟲的引誘效果明顯，達到顯著性水平；棕櫚酸和α-石竹烯對雄蟲的引誘效果不明顯，無選擇性差異。圖1

表1 雙斑長跗螢葉甲成蟲糞便揮發物的化學成分Table 1 Volatile composition of Monolepta hieroglyphica of feces

2.3.2 雙斑長跗螢葉甲雌蟲對4種揮發物的嗅覺行為反應

研究表明，在4種揮發物中，雌雙斑長跗螢葉甲成蟲對4種揮發物的偏好性從強到弱依次為α-紅沒藥醇(χ2= 6.30，P<0.05，n = 80)>α-蒎烯(χ2= 4.41，P<0.05，n = 80)>棕櫚酸(χ2= 0.58，P>0.05，n = 80)>α-石竹烯(χ2= 0.84，P>0.05，n = 80)，其中α-紅沒藥醇和α-蒎烯對雌蟲的引誘效果明顯，達到顯著性水平；棕櫚酸和α-石竹烯對雌蟲的引誘效果不明顯，無選擇性差異。圖2

表2 雙斑長跗螢葉甲對糞便中4種揮發物單品的EAG反應相對值Table 2 Relative EAG response of Monolepta hieroglyphica of 4 kind of volatile compounds of feces

注：表中數據為平均值 ± 標準誤，數字后字母表示同種揮發物不同濃度在P< 0. 05 水平 Duncan多重比較結果;*表示相同濃度下雌、雄蟲 EAG 反應值差異顯著性(P< 0. 05)；**表示差異極顯著性(P< 0.01)
Note：The date in the table are mean ± SE，and followed by letters indicate the results of same volatile on the different concentrations by Duncan’s multiple range test.*:P<0.05, different was significant;**:P<0.01, different was extremely significant

注：所得數據均經χ2檢驗，**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)，NS表示無選擇。下圖同

Note:The data obtained were all tested by χ2,**indicates that the difference was extremely significant (P<0.01),*indicates significant difference (P<0.05), and NS indicates no choice. The same picture below

圖1 雙斑長跗螢葉甲雄成蟲對4種揮發物單品的嗅覺行為反應
Fig.1 Behavior response ofMonoleptahieroglyphicaof male adults to the volatiles from four kinds

圖2 雙斑長跗螢葉甲雌成蟲對4種揮發物單品的嗅覺行為反應
Fig.2 Behavior response ofMonoleptahieroglyphicaof female adults to the volatiles from four kinds

3 討 論

植食性昆蟲對一定濃度范圍內的揮發性信息化合物的EAG反應率與揮發物濃度成正比[30]。在4種揮發物中，雙斑長跗螢葉甲雄成蟲對α-紅沒藥醇和α-蒎烯的反應值隨揮發物濃度的增加而增大，這與花絨寄甲、桃蛀螟雄蟲的反應規律較相似[31,32]。雙斑長跗螢葉甲雌成蟲對α-紅沒藥醇的反應值隨揮發物濃度的增加而增大，這與光肩星天牛雌蟲反應規律較相似[33]。t檢驗表明，雌雙斑長跗螢葉甲在一定濃度的揮發物刺激下具有明顯的EAG反應，且普遍高于雄蟲，部分顯著高于雄蟲，在一定濃度的同種揮發物刺激下，雌蟲觸角的敏感性要高于雄蟲。華山松大小蠹也存在這種類似現象[34]。不同性別的昆蟲個體對同種揮發物的氣味的反應存在著一定差異[35,36]，雌、雄雙斑長跗螢葉甲成蟲對同種濃度的α-紅沒藥醇和棕櫚酸刺激下反應差異極顯著，對α-紅沒藥醇和α-石竹烯個別濃度差異顯著。松墨天牛雌、雄蟲之間也存在這種相似現象[37]。雙斑長跗螢葉甲成蟲對α-紅沒藥醇、α-石竹烯和α-蒎烯具有較好的EAG反應效果。這與張志虎[19]和劉航[28]的研究結果相似。說明在雙斑長跗螢葉甲寄主植物揮發物和成蟲糞便中都含有誘集該害蟲的信息化合物有效成分，促進該蟲產生聚集行為。

“Y”型嗅覺行為反應中10 μL/mL的α-紅沒藥醇和α-蒎烯對雌、雄雙斑長跗螢葉甲的引誘效果明顯，α-紅沒藥醇為該葉甲寄主植物揮發物和成蟲糞便揮發物中所共有，α-蒎烯對松墨天牛和華山松大小蠹也都具有明顯的引誘效果[32,34]。棕櫚酸和α-石竹烯的引誘效果不明顯，其中α-石竹烯對該蟲有一定的趨避現象，但效果并不明顯。在嗅覺行為反應中雙斑長跗螢葉甲對α-石竹烯的反應并不明顯，這與EAG的測定結果有一定的差別，這說明EAG反應只能在一定程度上反映出昆蟲對該化合物是否具有一定的敏感性，但并不能確定具有EAG反應就同時具備嗅覺行為反應[38]。需要結合電生理反應和嗅覺行為反應才能有效篩選出該蟲糞便揮發物中對其具有引誘趨性的活性化合物。

4 結 論

在雙斑長跗螢葉甲成蟲糞便中測得包括醇類、酯類、酮類、酸類等共29種揮發性化合物，其中以酯類化合物的種類和含量最多；通過該葉甲雌、雄成蟲對選取的4種揮發性化合物的EAG反應，該葉甲雌、雄成蟲均對α-石竹烯、α-蒎烯、α-紅沒藥醇反應較明顯。并且雌、雄成蟲對于相同濃度的同種揮發物的反應，雌蟲的敏感性普遍更高。其雌、雄成蟲均對10 μL/mL的α-紅沒藥醇EAG反應效果最明顯，該葉甲雌、雄成蟲對α-紅沒藥醇的敏感性較高。且雌、雄雙斑長跗螢葉甲對α-紅沒藥醇的EAG反應值隨揮發物濃度的增加而增大；該葉甲雌、雄成蟲均對α-紅沒藥醇和α-蒎烯有較為明顯的趨性，對α-石竹烯和棕櫚酸無選擇性差異。α-紅沒藥醇和α-蒎烯可能為該葉甲成蟲糞便中的有效活性成分。