吡蟲啉在棉花上的殘留消解動態及對意大利蜂的急性毒性

李世奎，范繼文，寧忠雄，路 偉

(新疆農業大學農學院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】新疆棉花種植面積占全國種植面積的74.3%，已成為國內棉花供給的重要支柱[1-2]。隨著煙堿類殺蟲劑在新疆農業的廣泛使用，吡蟲啉等傳統煙堿類殺蟲劑對環境中非靶標生物尤其是傳粉昆蟲蜜蜂的安全性成為關注的焦點。【前人研究進展】劇曉青等[3]研究了吡蟲啉在茶葉的殘留分析方法及殘留動態，研究表明,吡蟲啉在鮮茶葉的半衰期分別是1.9～2.2 d。趙文晉等[4]采用高效液相色譜分析方法檢測了貴州開陽，黃平和桐梓3地吡蟲啉的殘留動態。結果表明,在稻田土壤中半衰期為2.79～3.03 d，在水稻植株中降解迅速，半衰期為1.73～2.14 d。仝東超等[5]通過田間試驗結果表明，按照1.5倍推薦劑量在小麥苗期手動噴施600 g/L吡蟲啉懸浮劑一次，吡蟲啉在土壤中殘留消解半衰期為6.6～10.0 d。Chauzat等[6]報道法國向日葵花粉的吡蟲啉平均為2～3 ng/g，是慢性中毒劑量的20～30倍，蜜蜂采集的花粉樣品中有69%樣品含有吡蟲啉及其代謝物。Godfray等[1]研究發現，花粉中的殘留量跨度很廣，在1.0～912 μg/kg。在南瓜花粉中吡蟲啉殘留是122 μg/kg，花蜜中是17.6 μg/kg。王成菊等[7]測定了1.7%阿維菌素/吡蟲啉微乳劑對蜜蜂的急性經口和接觸毒性，經口測得的LC50為1.790 mg/L，點滴法測得的LC50為0.039 mg/L。史曉斌等[8]試驗證實,吡蟲啉對蜜蜂也有很大傷害，亞致死劑量和慢性中毒就會影響蜜蜂的生理和行為?！颈狙芯壳腥朦c】2013年，歐盟限制吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪3種煙堿類殺蟲劑在禾谷類作物和蜜源作物上的使用[2]。2015年中國農業部在全國范圍內啟動實施了化肥農藥使用量“零增長”行動。研究吡蟲啉在新疆棉花種植區的殘留與消解動態，評估其對傳粉昆蟲蜜蜂的安全性?！緮M解決的關鍵問題】測定吡蟲啉在新疆棉田的殘留消解動態及對意大利蜂(Apismellifera)的急性接觸毒性，為吡蟲啉在新疆棉區使用時對傳粉昆蟲意大利蜂的安全風險提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試生物

試驗蜜蜂蜂種為意大利蜂成年工蜂，試驗生物由沈陽市化工研究院于洪區王兵養殖場提供。意大利蜂于試驗前1 d收集，飼養于蜂籠內，飼喂50%蔗糖水，放置在試驗環境中保持24 h適應期，適應期結束后剔除死亡或表現異常的個體，選擇大小一致健康的成年工蜂作為試驗測試的標準蜂。

1.1.2 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯質譜系統UPLC-MS/MS(Waters Acquity I-Class系列超高效液相色譜系統、Waters Xevo TQ-S質譜)。

95%吡蟲啉(imidacloprid)原藥(深圳諾普信農化股份有限公司)；70%吡蟲啉水分散粒劑(深圳諾普信農化股份有限公司)；乙腈(質譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，氯化鈉(分析純，天津北聯精細化學品開發有限公司)，無水硫酸鎂(分析純，天津北聯精細化學品開發有限公司)，C18粉末(北京青云有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 前處理方法

提取采用改進的 QuEChERS 方法。棉花樣品，在均質機中粉碎、勻漿，稱取10.00 g已經勻漿的棉花葉片、花朵或土壤樣品至50 mL離心管，加入乙腈10.00 mL，渦旋30 s，超聲5 min，再加入無水硫酸鎂4.00 g和NaCl 1.00 g，渦旋提取30 s，在4 500 r/min速率下離心5 min。取上清液2 mL于凈化離心管(C18 50 mg、無水硫酸鎂150 mg)，然后渦旋30 s，在10 000 r/min速率下離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18column (Waters：(2.1×50) mm、1.7 μm)。在電噴霧離子化源(ESI)，多重反應模式(MRM)進行分析。流動相為水-甲酸(99.9∶0.1)和乙腈，梯度洗脫程序如下：0～3 min 水-甲酸∶乙腈=9∶1，3～7 min 水-甲酸∶乙腈=6∶4，7 min后水-甲酸∶乙腈=9∶1。流動相的流速為0.3 mL/min。正模式下質譜條件：脫溶劑氣溫度和流速為500℃和800 L/Hr；毛細管電壓為3.5 kV。列出監測離子參數。表1

表 1 多重反應監測條件(MRM)Table 1 The multiple response monitoring (MRM) condition for analytes detection

1.2.3 田間試驗

棉花和土壤的施藥和采樣方法參照 NY/T 788-2004《農藥殘留試驗準則》進行[9]。于2019年在昌吉華興農場進行田間試驗。設置空白對照區、消解動態處理區，每個小區100 m2，每個處理3次重復，小區及處理間設置保護行。70%吡蟲啉水分散粒劑對水后，于棉花開花期時以75 g a.i./hm2均勻噴灑在棉花上部，施藥1次。于施藥后0、1、3、6、12 h和1、3、5、7 d采樣。每個小區隨機3點采集棉花葉片、花樣品各20 g以及土壤樣品40 g。裝入自封袋，粘好標簽，立即放于-20℃冰箱中保存，待測。

1.3 吡蟲啉對意大利蜜蜂急性接觸毒性

按照《化學農藥環境安全評價試驗準則(報批稿)第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》[10]的要求進行試驗，通過預試驗確定最高存活濃度和最低致死濃度。在預試驗濃度的基礎上，以一定的級差(級差小于2.2)設定4～6個濃度，用丙酮將藥劑配制成系列濃度，將度過適應期的意大利蜂用二氧化碳麻醉約4 min，迅速用微量點滴器將藥液點滴在意大利蜂的中胸背板處，點滴量為2.0 μL/蜂，蜂身晾干后轉入試驗蜂籠內，用50%蔗糖水飼喂。每個處理3個重復，每個重復10只蜜蜂，并設置對照組。觀察24和48 h試驗用蜜蜂有無中毒癥狀及死亡現象，記錄死亡數，對試驗數據進行統計，計算24和48 h LD50值及95%置信限。

2 結果與分析

2.1 線性范圍及檢出限

準確稱取吡蟲啉標準品，用乙腈配制成1 000 mg/L母液，再用乙腈逐級稀釋為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L系列標準溶液。按照上述條件測定，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，分別進行線性回歸。在0.01～1.0 mg/L質量濃度范圍內，吡蟲啉的峰面積(y)與濃度(x)呈線性關系，回歸方程為y=4 010.25x+2 746.69，相關系數r為0.998 7，最低檢測濃度為0.02 mg/kg。表 2

2.2 準確度及精密度

采用標準添加法，在棉花葉片和土壤空白樣品中，添加0.02、0.10 mg/kg 2個質量分數水平的吡蟲啉標準溶液，每個水平重復5次，測定添加回收率。在棉花葉片和土壤樣品的添加回收率介于94.27%～101.63%，相對偏差率介于2.01%～3.85%，符合農藥殘留試驗準則中對殘留檢測方法的要求，吡蟲啉峰型及響應值均較好，能夠確保結果判斷的準確性 。表3，圖1

表 3 吡蟲啉在棉花葉片和土壤中的添加回收率Table 3 Recoveries of Imidacloprid in cotton leaf and soil samples at different levels

2.3 吡蟲啉在棉花葉片、花及土壤中的消解動態

研究表明，吡蟲啉在棉花葉中的消解速率相對于土壤中較快，其在棉花葉片中的消解半衰期4.02 d，在棉花花中的消解半衰期4.30 d，在土壤中的消解半衰期為5.27 d。消解過程均呈負指數函數變化，相關系數均R>0.7，符合一級反應動力學方程，吡蟲啉在棉花及土壤中的半衰期<30 d，屬于易降解農藥。表4

圖 1 吡蟲啉的TIC圖
Fig.1 TIC spectrogram of Imidacloprid表4 吡蟲啉在棉花植株及土壤中的消解動態
Table 4 Degradation dynamics of Imidacloprid in cotton plants and soil

間隔期Interval殘留量Residualquantity(mg/kg)葉片花土壤0h0.7420.2960.3181h0.6550.2870.2983h0.6460.3440.2616h0.5220.5270.21512h0.2740.4190.3281d0.4060.1880.2423d0.2110.0420.0785d0.0460.0240.1777d

2.4 吡蟲啉對意大利蜜蜂急性接觸毒性

研究表明，意大利蜜蜂的死亡率與吡蟲啉呈現出明顯的線性關系。吡蟲啉對意大利蜜蜂急性經口毒性試驗的24 h LD50為0.072 7 μg a.i./bee；48 h LD50為0.064 9 μg a.i./bee。吡蟲啉毒性等級為高毒 。表5，表6

表6 農藥對蜜蜂毒性等級劃分Table 6 Classification of pesticide toxicity to bees

3 討 論

吡蟲啉是煙堿類殺蟲劑的代表品種，具有良好的內吸性，施用后會迅速被植物的根、莖、葉吸收并分布到整個植株，包括花和花粉。害蟲取食含有吡蟲啉的植物汁液而中毒死亡，非靶標昆蟲也可以通過直接接觸和間接取食害蟲的方式接觸吡蟲啉。已有研究表明，在植物花粉中煙堿類殺蟲劑的檢出率極高，這與全球的蜜蜂消失癥候群有一定的相關性。Brandt[11]等發現87%的玉米花粉樣品能夠檢出吡蟲啉，檢出量大部分在10 μg/kg以下。Godfray等[2]研究發現,吡蟲啉在花粉中的檢出率和殘留量都高于花蜜，若在植物拌種時使用吡蟲啉，則花粉中殘留量在1～51 ng/g；花蜜中為 1～8.6 ng/g；若用吡蟲啉處理土壤時，花粉中吡蟲啉含量約為9～66 ng/g，花蜜中吡蟲啉含量約為1～23 ng/g。吡蟲啉田間使用量約為100 mg/L，而吡蟲啉對蜜蜂的胃毒毒性為66.7 mg/L，說明蜜蜂在接觸到田間正常使用的吡蟲啉濃度時就會面臨死亡威脅。煙堿類殺蟲劑的使用會大大降低采集蜂的歸巢能力[12]，影響蜂群的衛生行為[13]。Prisco等[14]的研究中發現噻蟲胺可以使蜜蜂體內殘翅病毒(DWV)的爆發。

2013年12月，歐盟限制吡蟲啉，噻蟲胺，噻蟲嗪3種煙堿類殺蟲劑在禾谷類作物和蜜源作物上的使用[2]。而巴西、加拿大、美國等國家正在對3種新煙堿類殺蟲劑進行常規性再登記評價，以期降低或避免其對蜜蜂種群的危害[15]。2018年9月1日，法國政府宣布禁止吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪3種煙堿類殺蟲劑的使用。試驗測定了吡蟲啉在昌吉地區的殘留量及對蜜蜂的急性接觸毒性，從試驗結果可以看出，吡蟲啉對意大利蜜蜂的高毒。因此，應高度關注其他傳統煙堿類殺蟲劑在新疆棉田使用時對傳粉昆蟲及其他天敵的安全性。

4 結 論

建立了吡蟲啉在棉花植株和土壤中的UPLC-MS殘留分析方法，前處理采用高效快速的QuEChERS方法，該方法重現性好，操作簡單，最低檢測濃度LOQ為0.02 mg/kg，滿足我國農藥殘留分析試驗準則的要求。雖然吡蟲啉在棉花葉片、花和土壤中的消解半衰期均小于7 d，但根據吡蟲啉對意大利蜂急性接觸毒性的實驗結果，吡蟲啉的毒性等級為高毒。在新疆棉區使用吡蟲啉或其他傳統煙堿類殺蟲劑時，應加強關注該類殺蟲劑對傳粉昆蟲及其他天敵的安全性，提倡使用對傳粉昆蟲低毒的新一代煙堿類殺蟲劑作為替代產品在新疆棉區推廣使用。