啤酒花揮發(fā)油成分及其殺螨活性分析

趙娜娜，傅文佳，路 偉，古麗米熱，杜書亞

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】啤酒花HumuluslupulusL. 是桑科葎草屬一種多年生攀援草本植物，原產(chǎn)于歐洲、美洲和亞洲地區(qū)。中國(guó)新疆和四川北部均有野生資源分布，各地多有栽培，是釀造啤酒的原料，在啤酒釀造中，啤酒花具有不可替代的作用；除此之外，啤酒花還具有抗腫瘤、防治骨質(zhì)疏松癥和抗氧化等功能[1]；目前對(duì)其殺蟲活性研究，僅有國(guó)外研究證明啤酒花超臨界CO2萃取物對(duì)3種倉儲(chǔ)害蟲谷象、雜擬谷盜和谷斑皮蠹具有拒食活性，表明啤酒花萃取物是可以作為防治倉儲(chǔ)害蟲的一種潛在拒食劑[2]。啤酒花具有開發(fā)為天然植物源農(nóng)藥的潛力。土耳其斯坦葉螨是危害棉花、玉米、果樹、蔬菜等多種農(nóng)作物的重要害螨[3-7]，在中國(guó)僅分布于新疆地區(qū)[8-11]，在新疆地區(qū)普遍發(fā)生，是北疆棉花害螨的優(yōu)勢(shì)種群，給棉花生產(chǎn)帶來很大的影響[12, 13]。目前國(guó)內(nèi)外防治土耳其斯坦葉螨的主要手段依然是化學(xué)防治，但是高毒高殘留農(nóng)藥的不合理選擇和使用，對(duì)環(huán)境和生態(tài)造成污染和危害[14]。且由于土耳其斯坦葉螨繁殖速率快、世代周期短，短期內(nèi)對(duì)一些常用殺蟲劑可以產(chǎn)生強(qiáng)抗性，給防治帶來了很大的挑戰(zhàn)，也成為制約新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵因子[15]。篩選出高效、低毒、對(duì)環(huán)境友好的新型生物農(nóng)藥勢(shì)在必行。研究生物殺螨劑對(duì)棉葉螨的防治效果和毒力，對(duì)棉田殺螨劑的合理使用具有指導(dǎo)意義[16]。【前人研究進(jìn)展】植物源農(nóng)藥是一類來源于植物體的農(nóng)藥，其有效成分通常不是單一化合物，而是植物有機(jī)體中的一些、甚至大部分有機(jī)物質(zhì)。因其具有環(huán)境友好、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性、作用方式特異、促進(jìn)作物生長(zhǎng)并提高抗病性、種類多、開發(fā)途徑多等特點(diǎn)，在瓜、果、蔬菜、特種作物(茶、桑、中草藥、花卉等)及有機(jī)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注和應(yīng)用[17]。黃花蒿、姜黃、丁香、青蒿、側(cè)柏葉、羊蹄根、地錦、石榴籽、木鱉子、大山芝麻、沙茴香、鹽膚木、艾蒿、牽牛子、牛至子等多種植物對(duì)朱砂葉螨具有生物活性[18-33]；白花丹、紫莖澤蘭、藿香、北細(xì)辛等植物對(duì)柑桔全爪螨具有較好的生物活性[34，35]；狼毒、苦參、百部、臭椿等植物對(duì)二斑葉螨具有生物活性[36]；紫丁香、黃連木、鹽膚木、南方六道木、沙茴香和水芹等對(duì)酢漿草如葉螨具有較好的毒殺作用[37]；核桃青皮、火炬樹、河朔蕘花對(duì)山楂葉螨具有生物活性[38-40]。【本研究切入點(diǎn)】已有的研究報(bào)道明確了從植物中可以獲得比較理想的殺螨活性物質(zhì)，為研究開發(fā)植物性的殺螨劑奠定了一定的基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了多種植物具有防治葉螨的作用，然而利用植物源提取物防治土耳其斯坦葉螨的相關(guān)研究還較少。研究啤酒花揮發(fā)油成分及其殺螨活性。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究4種植物精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的殺螨活性，通過水蒸氣蒸餾法提取4種植物精油，葉片浸漬法測(cè)定不同植物精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的毒力，評(píng)價(jià)不同精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的觸殺活性，為植物源殺螨劑的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物

選用4種具有生物活性的植物作為研究材料，啤酒花、香青蘭、驅(qū)蟲斑鳩菊、歐洲鱗毛蕨均采自新疆維吾爾自治區(qū)。所有植物標(biāo)本保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲系天然產(chǎn)物與化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。表1

表1 4種植物名錄Table 1 Four plants directory

1.1.2 供試蟲源

土耳其斯坦葉螨于2017年6月采自新疆沙灣縣棉花田的自然種群，采集前棉田未施用任何藥劑。將采集的棉葉螨接到室內(nèi)種植的盆栽辣椒上，飼養(yǎng)多代后再挑選同一批次、大小一致的成螨作為試螨，試螨不分雌雄。

飼養(yǎng)條件：接種后的盆栽棉花置于人工氣候箱內(nèi)，氣候箱設(shè)置溫度26～28°C，相對(duì)濕度為75%，光照黑暗時(shí)間為14 h∶8 h (L∶ D)。

1.1.3 試劑與儀器

儀器：連續(xù)蒸餾裝置，北京玻璃儀器廠；

SHZ-DIII循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司；

RE-52CS型號(hào)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

數(shù)控升降式水浴鍋：上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子天平：天馬衡基FA1004；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：寧波萊福科技有限公司；

培養(yǎng)板：12孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

試劑：正己烷(分析純)、丙酮、無水硫酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；

聚四氟乙烯：上海三愛富有限責(zé)任公司。

1.2 方 法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取植物精油

通過水蒸氣蒸餾法提取歐洲鱗毛蕨、啤酒花、香青蘭、驅(qū)蟲斑鳩菊4種植物的精油。將0.5 kg曬干的植物放入到3 000 mL的圓底燒瓶，對(duì)水2 000 mL，用水蒸氣蒸餾法蒸餾3～4 h，所得油水混合物用正己烷萃取，萃取所得物用無水硫酸鈉脫水后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)濃縮(40℃)回收正己烷，所得殘留的油狀液即為精油，測(cè)比重，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 觸殺活性測(cè)定

生測(cè)方法結(jié)合參考FAO葉片浸漬法做了一些改進(jìn)，配制濃度為2%的瓊脂，將加熱后的瓊脂倒入12孔的培養(yǎng)板內(nèi)，瓊脂高度約為0.5 cm，置于-4℃冰箱內(nèi)備用。將田間采集未施藥劑的新鮮棉花葉片洗凈晾干，用直徑為2 cm的打孔器打孔待備用；以丙酮為溶劑配制4 mL的藥劑，棉花葉片在溶液中浸泡10 s后，用鑷子夾出，置于濾紙上自然揮發(fā)2 min，然后葉背朝上置于已倒好的瓊脂上，挑取10頭健康一致的成螨于葉片上，宣紙蓋在培養(yǎng)板上，固體膠封好，置于溫度為25℃、濕度為70%的溫箱內(nèi)。24 h后，觀察和記錄試螨的死亡情況。每個(gè)濃度重復(fù)5次，每個(gè)重復(fù)10頭試螨，丙酮不加藥劑作為空白對(duì)照。用毛筆撥動(dòng)螨體，螨體不動(dòng)即為死亡。

死亡率(%)=100×死螨數(shù)/試螨數(shù)；

校正死亡率(%)=100×[處理組死亡率-對(duì)照組死亡率/(1-對(duì)照組死亡率)]；

半致死濃度(LC50)即引起50%土耳其斯坦葉螨死亡率的濃度，使用Probit軟件包計(jì)算得到半致死濃度。

1.2.3 GC-MS測(cè)定精油化學(xué)成分

樣品送至北京師范大學(xué)分析測(cè)試中心。

采用美國(guó)Bruker公司450GC-320MS三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，配備BP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)。EI離子源溫度210℃；傳輸線溫度250℃；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣量1 μL，分流比1∶10。升溫程序：起始溫度50℃，停留5 min，之后以10℃/min的速率升溫至290℃，停留15 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物活性

研究表明，在藥劑濃度為60.00 mg/mL時(shí)，啤酒花精油的致死率高達(dá)100.00%，香青蘭致死率84.00%，驅(qū)蟲斑鳩菊、歐洲鱗毛蕨的致死率分別為48.00%、40.00%；在濃度為40 mg/mL時(shí)，啤酒花精油的致死率高達(dá)96.00%，香青蘭精油的致死率分別為78.00%，驅(qū)蟲斑鳩菊的致死率為38.00%，歐洲鱗毛蕨的致死率為8.00%；在濃度為26.70 mg/mL時(shí)，啤酒花的致死率高達(dá)88.00%，香青蘭的致死率為54.00%，驅(qū)蟲斑鳩菊的致死率為28.00%，歐洲鱗毛蕨無活性；在濃度為18.30 mg/mL時(shí)，啤酒花精油的致死率仍然高達(dá)70.00%，香青蘭、驅(qū)蟲斑鳩菊的致死率分別為26.00%、16.00%；在濃度為11.70 mg/mL時(shí)，各植物精油的活性均減弱甚至無活性，活性較好的為啤酒花精油，致死率36.00%；在濃度為8.00 mg/mL時(shí)，僅有啤酒花有較弱活性，致死率為24.00%。表2

表2 土耳其斯坦葉螨經(jīng)4種精油處理24 h后校正死亡率Table 2 Correct mortality of the 4 essential oils against T. turkestani adults after 24 h(%)

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小字母表示0.05水平上差異顯著
Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

研究表明，啤酒花、香青蘭精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的觸殺活性較好，LC50分別為13.30、126.28(mg/mL)，驅(qū)蟲斑鳩菊精油的觸殺活性較弱，LC50為47.50 mg/mL，活性最差的是歐洲鱗毛蕨精油，LC50為83.09 mg/mL。表3

表3 4種精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的觸殺活性Table 3 Contact toxicity of the 4 essential oils against T. turkestani adults

2.2 啤酒花精油的化學(xué)成分

啤酒花精油通過GC-MS檢測(cè)并鑒定出48個(gè)峰，其中出峰時(shí)間在20.228 min時(shí)的物質(zhì)含量最高。圖1

圖1 啤酒花精油離子譜
Fig. 1 Total ion chromatogram of the essential oil fromH.lupulus

通過分析鑒定出啤酒花精油化學(xué)成分中大于1%的有28個(gè)化合物，如表4。主要成分為1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氫-γ-鉻烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)等。圖1,表4

3 討 論

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，土耳其斯坦葉螨對(duì)啤酒花精油很敏感，其LC50值為13.30 mg/mL；將各精油按毒力大小排序依次為：啤酒花、香青蘭、驅(qū)蟲斑鳩菊、歐洲鱗毛蕨。啤酒花精油經(jīng)GC-MS鑒定，主要成分為1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氫-γ-鉻烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)，這3種化學(xué)成分很有可能是其關(guān)鍵活性成分，但還有待下一步分離純化、生物測(cè)定驗(yàn)證。

目前研究多關(guān)注啤酒花在釀酒方面的作用，鮮有其殺蟲殺螨活性報(bào)道。國(guó)內(nèi)僅有1篇文獻(xiàn)涉及植物精油對(duì)土耳其斯坦葉螨的生物活性[41]，其他大都集中在朱砂葉螨、二斑葉螨的生物活性研究方面；有文獻(xiàn)報(bào)道迷迭香、薄荷等精油及其主要化學(xué)成分對(duì)土耳其斯坦葉螨的熏蒸活性[42]。有必要進(jìn)一步開發(fā)植物資源，為土耳其斯坦葉螨的生物防除提供理論依據(jù)；進(jìn)行生物活性測(cè)定以及殺螨活性物質(zhì)的分離、鑒定，為植物源殺螨劑的研制提供技術(shù)數(shù)據(jù)。殺螨植物中的活性物質(zhì)一般可以直接利用，也可以通過分離純化活性植物確定關(guān)鍵活性成分，關(guān)鍵活性成分的確定可為農(nóng)藥成分的合成提供先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，新的功能集團(tuán)可延緩降低害螨的抗性發(fā)展，對(duì)活性成分進(jìn)行修飾合成，為進(jìn)一步研制殺螨農(nóng)藥新品種奠定理論基礎(chǔ)。如以姜黃素為原料合成了1種苯腙類姜黃素衍生物，結(jié)果表明，姜黃素及其衍生物對(duì)柑桔全爪螨、朱砂葉螨、腐食酪螨都有不同程度的觸殺作用[43]。但是，目前對(duì)殺螨植物中活性成分分離鑒定的研究仍較少，大都集中在對(duì)殺螨植物的篩選與生物活性測(cè)定上。研究接下來要對(duì)啤酒花精油進(jìn)行分離純化，以生物活性為指導(dǎo)進(jìn)行硅膠柱層析分離，并結(jié)合核磁共振技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等確定活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

表4 啤酒花精油化學(xué)成分(>1%)Table 4 Chemical compositions of the essential oil from H. lupulus (>1%)

在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)各精油的殺螨活性與殺蟲活性并不一致，如殺螨活性最好的植物是啤酒花，而殺嗜卷書虱活性最好的是椒蒿、驅(qū)避赤擬谷盜活性最好的植物卻是香青蘭，這可能與昆蟲和螨具有不同的生理構(gòu)造有關(guān)，也與生物測(cè)定的方法有關(guān)，對(duì)葉螨活性好的植物對(duì)昆蟲的活性不一定好，不同的昆蟲活性也不一定一致，在篩選農(nóng)藥活性化合物時(shí), 不能一味單調(diào)的追求針對(duì)某一昆蟲的殺蟲效果或殺螨效果，而應(yīng)該綜合測(cè)試植物提取物或活性化合物對(duì)不同靶標(biāo)生物的活性。

4 結(jié) 論

4種參試植物中，啤酒花、香青蘭、驅(qū)蟲斑鳩菊精油對(duì)土耳其斯坦葉螨具有較好的觸殺活性，其中啤酒花精油的活性最好，有發(fā)展為天然殺螨劑的潛力。啤酒花精油通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，主要成分為1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氫-γ-鉻烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)，3種化合物都有可能是活性化合物。