食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003對泡菜代謝物及風味的影響

徐亞洲 熊 濤 謝書虎 肖陽生 劉長根

(南昌大學生命科學與食品工程學院食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

泡菜發酵過程中的乳酸菌直接或者間接影響泡菜的風味代謝物質以及泡菜品質[1-4]，已有研究[5]發現乳酸菌發酵泡菜鹵水中風味代謝物與泡菜品質的差異，然而目前研究還未考慮到泡菜原材料攜帶的乳酸菌對泡菜品質的影響，缺乏乳酸菌泡菜發酵過程中組成風味物質的碳水化合物、有機酸、氨基酸以及揮發性物質動態變化的考察以及對風味成分的聯合分析，尚未考慮基于感覺閾值差異的風味代謝物質對泡菜品質的貢獻。試驗擬對泡菜原材料滅菌處理后，以食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003作為起始發酵菌株純種發酵泡菜，監測食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵泡菜及自然發酵泡菜中的代謝物的動態變化，通過風味物質的香氣活度值與主成分分析考察不同發酵方式泡菜中代謝物與風味的特點，以期為泡菜品質改良與泡菜產業化發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

新鮮圓白菜、冰糖、碘鹽、辣椒、姜、大蒜、花椒：市售；

MRS培養基：美國Sigma公司；

蔗糖、果糖、葡萄糖、乙酸、乙醇、乳酸：分析標準品，美國Sigma公司；

濃硫酸、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鐵、氯化鈉：分析純，上海國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

pH計：pHS-25型，上海精密科學儀器有限公司；

液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫公司；

氣質聯用儀：Agilent7820A氣相-5977B型，美國安捷倫公司；

氨基酸分析儀：S-433D型，北京捷盛依科科技發展有限公司；

生化培養箱：DNP-9272型，上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌培養與發酵菌劑的制備 從傳統四川發酵泡菜中分離得到食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003，轉接于MRS液體培養基中，37 ℃培養48 h后離心(5 000 r/min，10 min，4 ℃)，用0.85% NaCl溶液洗滌兩次，最后使用0.85%的NaCl溶液調節菌體濃度至9 lg (CFU/mL)。

1.3.2 泡菜的制備與取樣

(1) 泡菜配方[6]：每100 mL水中，添加白菜50 g，冰糖4 g，碘鹽4 g，辣椒4 g，大蒜3 g，生姜2 g，花椒1.5 g。

(2) 樣品制備：泡菜原料混合均勻后分為4組，分別為食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵組，自然對照組與空白組，每個批次3個重復，自然發酵組不進行滅菌處理，室溫下自然發酵，食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵組滅菌(105 ℃，25 min)后接入食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵，空白組原材料滅菌后不接入其他菌株，室溫放置7 d。

(3) 取樣：泡菜從入壇開始發酵7 d，期間每隔24 h于超凈工作臺內取樣。

1.3.3 乳酸菌計數 取1 mL泡菜液加入到9 mL無菌生理鹽水中，適當稀釋后選擇3個合適的梯度稀釋液，分別取100 μL涂布于MRS固體培養基，每個梯度做3次平行涂布，37 ℃培養48 h。

1.3.4 pH值測定 采用pH計。

1.3.5 總酸含量測定 按GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》執行，總酸含量以乳酸計。

1.3.6 糖和有機酸含量測定 泡菜液于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm濾膜過濾，濾液用于高效液相色譜分析。色譜條件：進樣量20 μL，流動相5 mmol/L硫酸溶液，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測器檢測波長210 nm。選用示差折光檢測器檢測糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)含量，紫外檢測器檢測有機酸(檸檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、蘋果酸、丁酸)含量。

1.3.7 游離氨基酸含量測定 取2 mL泡菜液，離心(3 000 r/min，5 min，4 ℃)，取上清液1 mL，用2%磺基水楊酸稀釋5倍，漩渦震蕩30 s，靜置15 min；離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)；上清液用0.22 μm濾膜過濾，濾液用于氨基酸分析儀分析。

1.3.8 揮發性物質檢測 泡菜中揮發性成分由GC-MS分離鑒定，色譜柱為HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，膜厚度0.25 μm)。純度99.999%的氦氣作為載氣，載氣流速1.2 mL/min?？鞠錅囟绕鹗紴?0 ℃保持1 min，以16 ℃/min的速度升至175 ℃并保持1 min，以2 ℃/min的速度升至95 ℃并保持1 min，以2 ℃/min的速度升至110 ℃并保持1 min，以3 ℃/min的速度升至150 ℃并保持1 min，以6 ℃/min的速度升至200 ℃并保持8 min。質譜離子源電壓70 eV，離子源和傳輸線溫度分別為230，250 ℃。質量掃描范圍為m/z35～350。

1.3.9 代謝物香氣活度值分析 泡菜中代謝成分決定著泡菜的感官風味，但是人類對風味代謝物質感官不僅取決于風味物質的相對含量，同時取決于風味物質的感覺閾值，而采用感官評定的方式誤差較大，故依據泡菜風味代謝成分的香氣活度值[7]評價不同發酵方式的泡菜風味。

(1)

式中：

O——香氣活度值；

C——物質的絕對濃度；

T——感覺閾值。

由于Si=fi×Ci，所以

(2)

式中：

OA，OB——組分A、B的香氣活度值；

f1,f2——氣相色譜中組分A、B的峰面積的相對校正因子；

Si——組分i的峰面積；

Ti——組分i的感覺閾值。

風味物質的O值越高，則該風味組分對泡菜整體風味的貢獻越大，結合主成分分析，對泡菜風味物質進行降維，乳酸菌純種發酵泡菜過程中含量變化較大且不同發酵方式泡菜中差異較大的風味組分可作為泡菜風味的特征風味物質。

2 結果與分析

2.1 pH與酸度

如圖1所示，總體來說，純種發酵泡菜的pH值高于自然發酵泡菜，酸度低于自然發酵泡菜，可能是高溫滅菌處理使原材料中的物質進入鹵水中導致的[6]，空白組中較高的pH值也從側面證實了這一點。自然發酵泡菜的酸度大于純種發酵泡菜，表明試驗篩選的兩株異型發酵乳酸菌產乳酸能力低于自然發酵泡菜中的多菌種發酵，Xiong等[8]對泡菜中乳酸菌的研究也得到了相似的結論。食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜的pH值高于檸檬明串珠菌NCU027003發酵泡菜，酸度小于檸檬明串珠菌NCU027003接種泡菜，說明食竇魏斯氏菌NCU034005發酵產乳酸能力小于檸檬明串珠菌NCU027003，該結果與圖4(g)中顯示的乳酸含量動態變化一致。自然發酵泡菜與檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵泡菜發酵后期鹽水中的pH值變化趨于平緩，且pH值相差不大。檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵泡菜與食竇魏斯氏菌NCU034005純種發酵泡菜的酸度相近，而自然發酵泡菜的酸度大于接種發酵泡菜，自然發酵泡菜是多菌種協同發酵，發酵后期，同型發酵菌株作為優勢菌產乳酸[1]，使自然發酵泡菜中的酸度較高，而食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003是異型發酵菌株，產酸與耐酸能力相對較弱，使泡菜發酵后期pH值趨于平緩[9]。檸檬明串珠菌NCU027003與食竇魏斯氏菌NCU034005對泡菜酸度的貢獻較小，自然發酵泡菜中多菌種協同發酵有利于泡菜pH值迅速下降，致使泡菜迅速成熟，有研究[10-11]表明泡菜發酵前期以耐酸性較弱的球菌屬為主，發酵中后期主要是耐酸性較強的同型發酵乳酸菌(如植物乳桿菌)，與試驗結果一致。

圖1 發酵過程中泡菜pH與酸度的動態變化

2.2 乳酸菌純種發酵泡菜過程中菌系的動態變化

如圖2所示，泡菜發酵起始階段純種發酵泡菜鹵水中乳酸菌數約為106～107CFU/mL，自然發酵活菌總數為103～104CFU/mL，而空白組鹵水乳酸菌含量幾乎為0 CFU/mL，且在整個發酵過程乳酸菌含量未有顯著變化，說明滅菌效果良好，有效地排除了原材料表面附著的微生物對試驗結果的干擾。乳酸菌純種發酵泡菜中乳酸菌含量先上升后下降，可能是泡菜接種乳酸菌的作用，純種發酵泡菜中食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003的乳酸菌數在早期迅速上升，有研究[9]表明異型發酵菌株耐酸性弱，導致了純種發酵泡菜中乳酸菌數逐漸下降。自然發酵泡菜中后期乳酸菌含量高于純種發酵泡菜，表明泡菜中耐酸能力較好的同型發酵乳酸菌逐漸增殖，與其他研究[12]結果相似，試驗中篩選得到的食竇魏斯氏菌NCU034005耐酸性弱于檸檬明串珠菌NCU027003。

圖2 發酵過程中泡菜乳酸菌活菌數的動態變化

Figure 2 Dynamic changes of viable lactic acid bacteria of paocai during the fermentation

2.3 乳酸菌純種發酵泡菜過程中代謝物的動態變化

2.3.1 碳水化合物 由圖3可知，蔗糖含量逐漸下降，果糖與葡萄糖含量逐漸上升，與Jeong等[13]的試驗顯示的游離糖含量均上升及Choi等[14]的試驗顯示所有的游離糖均下降有所不同，可能是試驗所用的乳酸菌與原材料差異導致的。

如圖3(a)所示，幾種泡菜中蔗糖含量均在0～1 d中小幅上升，可能是泡菜原材料中的營養物質滲透進入鹵液中導致的。自然發酵泡菜中的蔗糖含量低于純種發酵泡菜，且食竇魏斯氏菌NCU034005純種發酵泡菜中的蔗糖含量下降速度小于檸檬明串珠菌NCU027003發酵泡菜，說明自然發酵多菌種協同發酵對蔗糖的利用率高于食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵，檸檬明串珠菌NCU027003對蔗糖利用率高于食竇魏斯氏菌NCU034005，與其他研究[15-16]結果一致。

如圖3(b)所示，空白樣品中的葡萄糖含量基本不變，略有起伏，泡菜發酵過程中葡萄糖含量在0～1 d小幅下降，與圖3(a)中蔗糖含量的動態變化一致，與其他研究[8,17]比較，泡菜中葡萄糖含量較低，可能由于泡菜發酵前期乳酸菌適應泡菜環境，乳酸菌活動消耗葡萄糖與原材料中蔗糖轉化成葡萄糖的效率低于乳酸菌生成葡萄糖的效率。發酵前期，檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵泡菜與自然發酵泡菜中的葡萄糖含量逐漸上升，且檸檬明串珠菌NCU027003發酵泡菜中的葡萄糖上升速度大于自然發酵泡菜，食竇魏斯氏菌NCU034005純種發酵泡菜中葡萄糖含量低于其他3種泡菜，由圖2可知，純種發酵泡菜中的檸檬明串珠菌NCU027003菌數在1～3 d高于自然發酵中乳酸菌數，食竇魏斯氏菌NCU034005轉換蔗糖生成葡萄糖的能力遠低于自然發酵，可能導致了不同發酵泡菜中葡萄糖含量的不同。泡菜發酵后期，4種泡菜中的葡萄糖含量動態變化趨于平緩，可能是泡菜中乳酸菌消耗葡萄糖的量與生成葡萄糖的量相當導致的。泡菜中球菌屬乳酸菌一般可產生葡萄糖蔗糖酶將蔗糖轉換成葡萄糖[9,18]，加上泡菜酸環境以及乳酸菌自身活力的綜合作用，導致了不同乳酸菌發酵泡菜中葡萄糖含量的差異。

如圖3(c)所示，泡菜中的果糖含量動態變化趨勢相似，發酵前期小幅下降，發酵中期逐漸上升，發酵末期趨于穩定。而自然發酵泡菜中果糖的含量總體低于純種發酵泡菜，試驗結果表明，食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003可代謝蔗糖生成果糖，轉換效率相近。有研究[9]表明，球菌屬特別是腸膜明串珠菌屬是自然發酵過程中生成果糖的主要菌株?？瞻讟悠分泄呛康淖兓赡苁窃牧现械墓菨B透進入泡菜液中導致的。

圖3 發酵過程中泡菜蔗糖、葡萄糖與果糖含量的動態變化

不同異型發酵菌株代謝糖能力不同，冰糖的添加使泡菜中蔗糖含量增加，蔗糖作為冰糖中主要的糖類可以被蔗糖水解酶水解為果糖與葡萄糖，可能也是純種發酵泡菜中糖含量不同的原因之一，乳球菌屬尤其是檸檬明串珠菌NCU027003可分泌蔗糖轉化酶將蔗糖轉化成葡萄糖與果糖[9,19]，且檸檬明串珠菌NCU027003可高效利用蔗糖與葡萄糖[20-21]。

2.3.2 有機酸 如圖4所示，泡菜發酵過程中7種有機酸總體上升，檸檬明串珠菌NCU027003發酵泡菜液中除蘋果酸外的有機酸含量都高于其他發酵泡菜。檸檬明串珠菌NCU027003發酵泡菜與食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜中丁酸、琥珀酸、酒石酸含量高于自然發酵，而自然發酵泡菜中檸檬酸、乳酸、乙酸的含量介于檸檬明串珠菌NCU027003發酵泡菜與食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜之間，發酵中后期蘋果酸含量略高于檸檬明串珠菌NCU027003。發酵過程中酒石酸含量變化不大，可能是由于酒石酸不參與乳酸菌的生長代謝。檸檬酸含量在發酵中后期增長趨勢趨于平緩，Koduru等[22-23]發現檸檬酸和葡萄糖與果糖、乳糖或木糖通過乙酸激酶途徑代謝，泡菜中乳酸菌代謝檸檬酸，泡菜發酵中后期，檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵泡菜與食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜中的乳酸菌數降低，導致檸檬酸增長速度逐漸減慢。泡菜發酵過程中乳酸菌可以生成蘋果酸，一些乳酸菌可以通過蘋果酸乳酸酶將L-蘋果酸脫羧為L-乳酸和CO2[24]，導致了不同乳酸菌發酵泡菜中的蘋果酸含量不同。

由圖4(f)可知，檸檬明串珠菌NCU027003代謝產乳酸能力高于食竇魏斯氏菌NCU034005。泡菜發酵前期，接種乳酸菌使得純種發酵泡菜中乳酸菌含量較高，導致了純種發酵泡菜中乳酸迅速累積。研究[25]表明，同型發酵乳酸菌產乳酸能力高于異型發酵乳酸菌，自然發酵是多菌種協同發酵，發酵后期自然發酵泡菜中同型發酵菌是優勢菌株，使得自然發酵泡菜中的乳酸含量逐漸接近檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵泡菜。

圖4(g)中，檸檬明串珠菌NCU027003泡菜發酵過程中乙酸含量迅速增長，且高于自然發酵，可能是由異型發酵乳酸菌產乙酸較多，自然發酵泡菜中同型發酵乳酸菌產生乙酸含量較少導致的。有研究[25]表明，同型發酵乳酸菌代謝主要產乳酸，而異型發酵主要產乙醇、二氧化碳等物質。食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜中乙酸含量最少但高于空白樣，結合圖2可知，食竇魏斯氏菌NCU034005泡菜中的乳酸菌含量較低，故可能食竇魏斯氏菌NCU034005生成乙酸能力相對較弱導致的結果。總體來說，泡菜發酵過程中有機酸含量動態變化依賴于乳酸菌的活動，且乳酸菌發酵過程中乳酸含量高于乙酸含量，乳酸是造成泡菜酸環境的重要因素，與其他研究[25]結果一致。

2.3.3 氨基酸 如圖5所示，泡菜發酵過程中谷氨酸(Glu)與天冬氨酸(Asp)含量逐漸上升，絲氨酸(Ser)與丙氨酸(Ala)逐漸減少。脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)是發酵泡菜中含量較高的氨基酸，丙氨酸(Ala)在自然發酵泡菜中含量較高，其他種類游離氨基酸趨于穩定狀態，總體變化不顯著，而其他研究[13]發現發酵過程中氨基酸含量迅速增加，可能是由泡菜原材料、制作工藝、發酵菌株等因素導致的。

2.3.4 揮發性成分 如圖6所示，在不同乳酸菌發酵泡菜過程中共檢測出153種揮發性成分，包含32種醇、17種烯、15種酮、13種酯、10種生物胺與芳香化合物等揮發性物質，其中10種生物胺成分含量相對較低，主要存在于空白樣中，且在泡菜發酵后期生物胺含量逐漸為0。

不同發酵泡菜中的揮發性物質組成有顯著差別，食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜共檢測出93種揮發性成分，檸檬明串珠菌NCU027003發酵泡菜共檢測出55種揮發性成分，自然發酵泡菜共檢測出43種揮發性成分，空白原材料共檢測出了71種揮發性成分，食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003可顯著提高泡菜揮發性成分的種類。桉樹醇、松油醇、乙酸是3種發酵泡菜中主要的共有揮發性成分，樟樹醇是食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜中獨有的含量較高的揮發性成分，Jeong等[26]發現作為泡菜中重要的硫化物在試驗中也被檢測到。不同乳酸菌發酵泡菜產生的風味物質不同，而泡菜中多樣的乳酸菌與其各自的代謝產物豐富了泡菜風味[27]。

2.4 代謝物的主成分分析

為了比較兩種乳酸菌純種發酵泡菜的代謝物的差異，對不同發酵方式泡菜中的代謝產物進行主成分分析，主成分1的方差貢獻率為33.95%，主成分2的方差貢獻率為50.91%。如圖7所示，主成分分析載荷得分圖表明不同乳酸菌發酵泡菜的代謝物有良好的分離效果，分別聚集在3個不同區域，在乳酸菌發酵泡菜過程中，泡菜中代謝產物發生了顯著變化，空白組和食竇魏斯氏菌NCU034005泡菜的代謝物在發酵末期相近，檸檬明串珠NCU027003純種發酵泡菜中的代謝物與自然發酵泡菜代謝物距離相近。說明異型發酵菌株檸檬明串珠菌NCU027003比食竇魏斯氏菌NCU034005對泡菜發酵代謝風味貢獻更大。由圖7(b)可知，A81(龍腦)、A22(樟腦)、A57(α-異松油烯)、A204(4-乙酸松油烯酯)、A33(醋酸)、A31(左旋香芹酮)、A91(桉樹醇)、A153(3,7,7-三甲基二環[4.1.0]庚-3-烯)與蘋果酸、蔗糖等是區分幾種發酵泡菜差異的標志代謝物質。Nsogning等[28]也發現泡菜發酵過程中產生的醋酸是泡菜呈酸味的重要原因，而Hong等[29]發現泡菜發酵過程中形成的硫的衍生物在試驗中不是區分檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵泡菜與食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜的標志代謝物，可能是使用的菌株不同導致的。不同發酵泡菜代謝物差異顯著，檸檬明串珠NCU027003與食竇魏斯氏菌NCU034005以及自然發酵中的多種乳酸菌決定了風味各異的泡菜，不同乳酸菌有望產生品質各異的發酵泡菜。

圖5 發酵過程中泡菜氨基酸含量的動態變化

Figure 5 Dynamic changes of amino acid content during fermentation of paocai by different fermentation methods

圖6 不同方式發酵泡菜中的揮發性成分

Figure 6 Volatile components of paocai fermented by different fermentation methods

2.5 泡菜風味的PCA分析

為了準確評估不同發酵方式泡菜的風味代謝物，找出乳酸菌純種發酵泡菜過程中的特征風味物質，以自然發酵泡菜為標準，計算不同代謝物的香氣活度值，評價食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003純種發酵泡菜的風味，對乳酸菌純種發酵泡菜中不同香氣活度值的風味物質進行主成分分析，主成分1的方差貢獻率為38.45%，主成分2的方差貢獻率為48.94%。如圖8所示，不同乳酸菌發酵泡菜風味物質顯示了良好的分離效果，純種發酵泡菜的風味與自然發酵泡菜有顯著差異，食竇魏斯氏菌NCU034005發酵泡菜風味空白中風味相近，食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003對泡菜風味影響顯著且具有不同的影響，A8(d-檸檬烯)、A1(α-松油醇)、精氨酸、醋酸與乳酸、酸度、果糖等風味物質是可顯著區分泡菜風味差異的物質，不同發酵方式的泡菜中的酸度也有明顯的區別，純種發酵泡菜與自然發酵泡菜風味差異顯著，這是由于自然發酵泡菜風味是多菌種共同作用的結果。泡菜中乳酸菌的活動產生了泡菜獨特的風味，不同乳酸菌發酵泡菜的風味與品質差異明顯[30-31]，有研究[32]表明泡菜中風味的差別是由乳酸菌與酵母代謝產物引起的，還有研究[9]發現Leu.mesenteroides作為發酵劑可生產酸度更低、口味清爽的發酵泡菜，而試驗中的食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003也可作為泡菜風味改良的菌種資源，但作為異型發酵乳酸菌產酸能力較弱，不能迅速使泡菜成熟。

圖7 不同方式發酵泡菜代謝物的PCA分析

Figure 7 PCA analysis of metabolites of paocai fermented by different fermentation methods

圖8 不同方式發酵泡菜風味的PCA分析

Figure 8 PCA analysis of kimchi flavor fermented by different fermentation methods

3 結論

異型發酵乳酸菌食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003的耐酸性以及產酸能力較弱，兩株乳酸菌對碳水化合物、有機酸與氨基酸的代謝能力不同，而食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003發酵泡菜各具有獨特的風味，且與自然發酵泡菜風味差異顯著，可認為是影響泡菜風味品質的重要菌種，其中龍腦、樟腦、α-異松油烯、4-乙酸松油烯酯、醋酸、左旋香芹酮、桉樹醇等風味物質是泡菜中的特征風味因子，可作為監測泡菜品質的重要參考。食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003可作為泡菜風味改良的菌種資源。后續可進一步探究食竇魏斯氏菌NCU034005與檸檬明串珠菌NCU027003產特征風味物質的動力學關系以及其他種類乳酸菌純種發酵泡菜的風味差異，探究乳酸菌發酵泡菜風味產生機理。