野地瓜不同部位活性成分、抗氧化能力及其相關(guān)性分析

楊秀群 謝國芳 吳 倩陳 煉 陳 佳 劉永玲

(1. 貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550005；2. 貴陽學(xué)院教學(xué)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)管理中心，貴州 貴陽 550005；3. 貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005)

野地瓜又稱地枇杷、地石榴、地果等，桑科榕屬木質(zhì)藤本植物。野地瓜全株可入藥，是集綠化、觀賞、食用、藥用于一體的多用途植物，具有開發(fā)利用價(jià)值。

野地瓜主要有黃酮類及異黃酮類、有機(jī)酸、三萜類、甾體類、香豆素類等物質(zhì)[1-2]，其提取物具有抗菌、抗氧化、抗溶血、抗炎、止血、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、激活酪氨酸酶等作用[3-5]。研究[6]顯示，野地瓜藤和根具有清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基等抗氧化能力，但尚無野地瓜藤、葉和果實(shí)活性成分及其抗氧化能力方面的研究。試驗(yàn)擬以野地瓜藤、葉和果實(shí)為試材，對(duì)比分析其酚類組分、總酚、總黃酮及VC含量，使用總還原力(total reducing power assay，TRPA)、ABTS+自由基清除能力(free radical scavenging capacity of ABTS+，ABTS)和Fe2+的還原能力(ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)法進(jìn)行體外抗氧化能力評(píng)價(jià)，以期探索野地瓜不同部位抗氧化成分及其藥用價(jià)值，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野地瓜藤、葉和果實(shí)：采自貴州省遵義縣沙灣鎮(zhèn)八一村，挑選色澤鮮亮、顆粒飽滿、無機(jī)械損傷的成熟果實(shí)，用蒸餾水沖洗干凈，陰干水分，于-70 ℃超低溫冰箱凍藏備用；

9種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：分析純，純度≥95.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

三氟乙酸、甲醇(≥99.5%)：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

還原性抗壞血酸、蘆丁、水溶性VE、TPTZ、ABTS：美國Sigma公司；

C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)：沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

研磨機(jī)：IKA A11型，德國IKA公司；

超聲清洗器：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2550型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酚類物質(zhì)提取 稱取10 g凍樣研磨成漿，取2 g果漿裝入10 mL離心管中，加入4.0 mL 70% 甲醇溶液，50 ℃超聲波輔助提取30 min，冷卻后10 000 r/min離心15 min，將上清液過濾到10 mL的容量瓶中，加入3 mL 70%甲醇溶液于殘?jiān)性谔崛?0 min，在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，合并上清液，用70%甲醇溶液定容，用0.45 μm的濾膜過濾后待測，取1.0 mL轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中等待進(jìn)樣，每個(gè)樣品3次重復(fù)[7]。

1.3.2 酚類物質(zhì)分析 采用液相色譜法[7]。C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，溶液A(甲醇)和溶液B(3‰ 三氟乙酸)，利用溶液B進(jìn)行線性梯度洗脫：0～5 min，88% B；5～10 min，88%～75% B；10～15 min，75% B；15～20 min，75%～70% B；20～25 min，70% B；25～35 min，70%～65% B；35～40 min，65% B；40～50 min，50% B；50～55 min，88% B；55～60 min，88% B。柱溫30 ℃；流動(dòng)相速率0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測器波長280 nm。

1.3.3 活性成分測定

(1) 總酚含量：參照文獻(xiàn)[8]。

(2) 黃酮含量：參照文獻(xiàn)[9]。

(3) VC含量：參照文獻(xiàn)[10]。

1.3.4 抗氧化能力分析

(1) 對(duì)Fe2+的還原能力(FRAP)：參照文獻(xiàn)[11]。

(2) 總還原力(TRPA)：參照文獻(xiàn)[12]。

(3) ABTS+自由基清除能力(ABTS)：參照文獻(xiàn)[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)計(jì)3組平行，數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，使用 IBM SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)Duncan’s組間差異分析(P<0.05)和相關(guān)性分析，使用GraphPad Prism 7.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和野地瓜樣品高效液相色譜圖

多酚標(biāo)準(zhǔn)品和野地瓜樣品HPLC色譜圖見圖1。

2.2 各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

野地瓜各指標(biāo)、選用波長、回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

由表1可知，所測指標(biāo)總酚、總黃酮、VC、TRPA、FRAP和ABTS線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.998 0～0.999 9，表明測試方法具有較好的可靠性。

2.3 野地瓜藤、葉和果實(shí)中酚類物質(zhì)分析

野地瓜藤、葉和果實(shí)中酚類物質(zhì)含量見表2。結(jié)果顯示，野地瓜藤、葉和果實(shí)均含有所測9種酚類物質(zhì)，但主要組分存在差異，果實(shí)中酚類組分之和顯著高于葉和藤(P<0.05)，酚類物質(zhì)種類及其含量卻表現(xiàn)出無規(guī)律的顯著性差異。果實(shí)中主要酚類成分是綠原酸、蘆丁、表兒茶素、鞣花酸、沒食子酸和兒茶素等。葉中主要酚類成分為沒食子酸、蘆丁、綠原酸、表兒茶素和兒茶素等，藤中則主要是兒茶素、沒食子酸、蘆丁和綠原酸；葉中沒食子酸、蘆丁和槲皮素含量高于果實(shí)和藤，葉中沒食子酸含量分別是果實(shí)和藤的4.0倍和5.3倍，蘆丁含量分別是果實(shí)和藤的1.3倍和5.3倍，槲皮素含量分別是果實(shí)和藤的1.2倍和1.8倍；果實(shí)中綠原酸、表兒茶素和p-香豆酸含量顯著高于葉和藤(P<0.05)，果實(shí)中綠原酸的含量分別是葉和藤的5.7倍和30.0倍，表兒茶素分別是葉和藤的1.4倍和4.6倍，p-香豆酸分別是葉和藤的3.4倍和3.9倍。

1. 沒食子酸 2. 兒茶素 3. 綠原酸 4. 表兒茶素 5.p-香豆酸6. 阿魏酸 7. 鞣花酸 8. 蘆丁 9. 槲皮素

圖1 酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和野地瓜藤、葉和果實(shí)色譜圖

Figure 1 The chromatograms of standard and root, leaves and fruit ofFicustikouaBur.

表1所測指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程信息

Table 1 Regression equation information of standard curve of measured indicators

指標(biāo)波長/nm線性方程相關(guān)系數(shù)R2總酚760y=0.010 7x+0.115 30.998 9總黃酮512y=11.974 0x+0.015 60.999 9VC534y=0.017 2x+0.127 30.999 2TRPA700y=0.113 0x-0.052 40.999 0FRAP593y=0.086 9x-0.061 90.998 0ABTS734y=0.595 1x-0.304 30.998 2

2.4 野地瓜藤、葉和果實(shí)中VC、總酚、總黃酮含量分析

如圖2所示，野地瓜藤、葉和果實(shí)中總酚含量均顯著高于總黃酮和VC(P<0.05)；藤中總酚和總黃酮含量顯著高于葉和果實(shí)(P<0.05)，而葉中VC含量則顯著高于藤和果實(shí)(P<0.05)，說明野地瓜不同部位活性成分存在顯著差異。試驗(yàn)中，果實(shí)的酚類組分之和顯著高于葉和藤(P<0.05)；野地瓜果實(shí)中的VC含量為10 mg/100 g，與前期存在較大差異[1]，可能是由于產(chǎn)地和成熟度引起的。研究顯示，黃秋葵果實(shí)總酚含量顯著高于葉[14]，而金刺梨和八月瓜葉中總酚含量顯著高于果實(shí)[7,15]；黃秋葵和金刺梨果實(shí)中總黃酮含量顯著高于葉[7,14]；丹參、大花羅布麻和藍(lán)莓葉中總酚和總黃酮含量顯著高于莖[16-17]，然而紅海欖的總酚和黃酮含量莖>葉[18]；八月瓜和新疆紅棗果皮總黃酮含量均顯著高于果肉[15,19]，說明總酚和黃酮在不同種類植物的不同部位分布存在較大差異。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野地瓜不同部位總酚含量大小依次為藤>葉>果實(shí)，與金刺梨和八月瓜葉和果實(shí)的分布一致[7,15]，與紅海欖莖和葉中的分布一致[18]；野地瓜不同部位總黃酮依次為藤>果實(shí)>葉，與黃秋葵和金刺梨果實(shí)和葉中的分布一致[7,14]，與紅海欖莖和葉中的分布一致[18]。

表2野地瓜藤、葉和果實(shí)酚類組分含量分析?

Table 2 Polyphenol content in the root, leaf and fruit from Ficus tikoua Bur.mg/kg

? 同列小寫字母不同表示不同部位間差異顯著(P<0.05)。

小寫字母不同表示不同部位間差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Contents of VC, total phenols and total flavonoids in roots, leaves and fruits fromFicustikouaBur.

2.5 野地瓜藤、葉和果實(shí)抗氧化能力分析

如圖3所示，野地瓜3個(gè)部位均具有較強(qiáng)的總還原力(TRPA)、ABTS+自由基清除能力(ABTS)和對(duì)Fe2+的還原力(FRAP)等抗氧化活性。從野地瓜藤、葉和果實(shí)當(dāng)量濃度抗氧化能力比較發(fā)現(xiàn)藤、葉和果實(shí)對(duì)鐵的還原力(FRAP)和ABTS+自由基清除能力(ABTS)均顯著高于總還原力(TRPA)(P<0.05)；野地瓜果實(shí)除了TRPA略低于藤和葉外，F(xiàn)RAP顯著高于葉和藤(P<0.05)，約為葉和藤的2.0倍，ABTS也顯著大于藤和葉(P<0.05)，約為葉和藤的1.2倍；不同部位的抗氧化活性大小TRPA為藤>葉>果實(shí)，F(xiàn)RAP為果實(shí)>葉>藤，ABTS為果實(shí)>藤>葉，與圖1中抗氧化活性物質(zhì)總酚為藤>葉>果實(shí)，總黃酮為藤>果實(shí)>葉，VC為葉>藤>果實(shí)含量排序不一致，由此說明雖然總黃酮、總酚和VC與野地瓜的抗氧化活性存在相關(guān)性，但野地瓜各部位的主要抗氧化活性物質(zhì)可能不只有酚類物質(zhì)、黃酮及VC。野地瓜藤、葉和果實(shí)中的抗氧化活性差異較大，其總還原力(TRPA)、ABTS+自由基清除能力(ABTS)和對(duì)Fe2+的還原力(FRAP)等抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增加均呈增加趨勢(shì)。但各種抗氧化活性隨濃度增加的幅度不同。隨濃度的增加，葉的TRPA幅度較小，藤和果實(shí)的TRPA增加幅度較大，當(dāng)濃度增加到一定量時(shí)，藤和果實(shí)的TRPA與葉的差距變大；而藤和葉的ABTS隨濃度增大的增幅較小，果實(shí)的增幅較大，導(dǎo)致果實(shí)與藤和葉的ABTS差距變大；葉的FRAP隨濃度增加的增幅較大，果實(shí)的增幅較小，而藤的增幅先小后大。導(dǎo)致低濃度時(shí)FRAP大小為果實(shí)>葉>藤，且差距較大，高濃度時(shí)野地瓜藤、葉和果實(shí)的FRAP差距很小。

由表2可知，不同部位野地瓜提取物濃度與總還原力(TRPA)、抗氧化能力(FRAP)和ABTS+自由基清除能力的回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.958 5～1.000 0，均具有較好的可靠性。

2.6 各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

楊世波等[6]發(fā)現(xiàn)野地瓜根的乙醇提取物、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇及丙酮提取物能較好的清除DPPH、OH和O2-等自由基，其中乙醇提取物的清除能力最強(qiáng)，且抗氧化性隨各組分濃度的增加均呈上升的趨勢(shì)。野地瓜藤、葉和果實(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，總酚含量與兒茶素顯著正相關(guān)，與槲皮素極顯著負(fù)相關(guān)，與表兒茶素、鞣花酸、蘆丁顯著負(fù)相關(guān)，野地瓜不同部位兒茶素含量大小為藤>葉>果實(shí)，槲皮素、蘆丁含量為葉>果實(shí)>藤，表兒茶素含量為果實(shí)>葉>藤，鞣花酸含量為果實(shí)>藤>葉，正負(fù)相關(guān)導(dǎo)致總酚含量為藤>葉>果實(shí)；總黃酮與兒茶素、阿魏酸顯著正相關(guān)，兒茶素含量為藤>葉>果實(shí)，阿魏酸含量為葉>藤>果實(shí)，則總黃酮含量為藤>果實(shí)>葉；TRPA與總酚極顯著正相關(guān)，與兒茶素顯著正相關(guān)，與槲皮素極顯著負(fù)相關(guān)，總酚含量為藤>葉>果實(shí)，兒茶素含量為藤>葉>果實(shí)，槲皮素為葉>果實(shí)>藤，正負(fù)作用導(dǎo)致TRPA為藤>葉>果實(shí)；FRAP與綠原酸、鞣花酸、蘆丁極顯著正相關(guān)，與表兒茶素顯著正相關(guān)，與p-香豆酸極顯著負(fù)相關(guān)，與沒食子酸顯著負(fù)相關(guān)，綠原酸、表兒茶素和p-香豆酸含量均為果實(shí)>葉>藤，鞣花酸含量為果實(shí)>藤>葉，蘆丁和沒食子酸含量為葉>果實(shí)>藤，故FRAP為果實(shí)>葉>藤；ABTS與綠原酸、FRAP極顯著正相關(guān)，與鞣花酸、蘆丁顯著正相關(guān)，與p-香豆酸、VC極顯著負(fù)相關(guān)，與沒食子酸顯著負(fù)相關(guān)，綠原酸、p-香豆酸和FRAP含量均為果實(shí)>葉>藤，鞣花酸含量為果實(shí)>藤>葉，蘆丁、沒食子酸含量均為葉>果實(shí)>藤，VC的含量為葉>藤>果實(shí)，正負(fù)相關(guān)性導(dǎo)致ABTS為果實(shí)>藤>葉。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野地瓜藤、葉和果實(shí)醇提取物均有較強(qiáng)的FRAP、ABTS 和TRPA等體外抗氧化能力，其抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增加呈正相關(guān)增長，說明野地瓜全株皆有抗氧化活性，具有極大的開發(fā)潛力。同時(shí)野地瓜藤、葉和果實(shí)中乙酸乙酯及正丁醇等其他極性成分的抗氧化能力仍需進(jìn)一步深入研究。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，野地瓜不同部位的抗氧化活性物質(zhì)和抗氧化能力存在顯著相關(guān)性關(guān)系：ABTS與p-香豆酸、VC極顯著負(fù)相關(guān)，與沒食子酸顯著負(fù)相關(guān)，協(xié)同作用和拮抗作用最終導(dǎo)致ABTS為果實(shí)>藤>葉。由此可見，野地瓜各部位總酚和總黃酮的大小與其相關(guān)的酚組分含量大小有關(guān)，各部位抗氧化性的大小與其所含的抗氧化活性成分大小有關(guān)，該結(jié)果與丹參[16]、紅海欖[18]、新疆紅棗[19]和五味子[20]等研究結(jié)果一致。

表2不同部位濃度抗氧化能力的回歸方程信息

Table 2 Regression equation information of antioxidant activity in different parts

指標(biāo)部位回歸方程相關(guān)系數(shù)R2TRPA藤y=0.025 9x+0.675 10.998 8葉y=0.006 8x+1.183 50.979 5果實(shí)y=0.023 8x+0.505 40.994 2FRAP藤y=0.071 2x+0.408 50.998 4葉y=0.068 5x+0.825 00.998 7果實(shí)y=30.001 0x-0.003 61.000 0ABTS藤y=4.882 1x+16.863 00.996 5葉y=3.522 2x+19.605 00.958 5果實(shí)y=11.527 0x+2.5947 00.984 0

表3 活性成分、抗氧化能力及其相互間相關(guān)性分析?

? *和**分別表示在P<0.05和P<0.01水平上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論

通過對(duì)比分析野地瓜藤、葉和果實(shí)的VC、酚類組分、總酚及總黃酮等活性成分及其含量，發(fā)現(xiàn)各個(gè)部位均含有9種酚類物質(zhì)，但含量差異顯著。酚類組分主要為沒食子酸、兒茶素、鞣花酸、綠原酸、蘆丁和表兒茶素；體外抗氧化活性能力測定發(fā)現(xiàn)野地瓜藤、葉和果實(shí)均具有較好的FRAP、ABTS 和TRPA能力。當(dāng)量濃度時(shí)，F(xiàn)RAP、ABTS突出，果實(shí)的FRAP和ABTS均比藤和葉的強(qiáng)，藤、葉和果實(shí)的TRPA相當(dāng)。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加其抗氧化活性呈正相關(guān)增長；總酚對(duì)TRPA貢獻(xiàn)最大，鞣花酸對(duì)FRAP貢獻(xiàn)顯著，綠原酸對(duì)ABTS有顯著貢獻(xiàn)。野地瓜藤、葉、果實(shí)部位各種酚類物質(zhì)含量不同，抗氧化能力各有優(yōu)勢(shì)，可以根據(jù)不同需要充分開發(fā)利用野地瓜資源。