食用油中黃曲霉毒素B1快速檢測試紙的評價

張 威，張文中，郭 平*，胡重怡，呂小麗

（江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001）

據聯合國糧食與農業組織估計，全球的糧食作物及其產品中大約有1/4存在霉菌毒素污染[1-2]，給全球農業經濟帶來巨大損失[3]。這些毒素大部分具有肝臟毒性、腎臟毒性、致癌性、致畸性和致突變性等[4]。在所有霉菌毒素中，黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）較為常見，而且毒性較強，據美國疾病控制中心報道，全球大約有45億 人面臨AF的暴露風險，主要集中在發展中國家[5]。AF是一大類結構相似的化合物，屬于二氫呋喃香豆素的衍生物。其中，黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最為常見且毒素最強，其急性毒性是氰化鉀的10 倍、砒霜的68 倍，主要存在于花生、核桃、大豆、稻谷、玉米、小麥等農作物及其油類副產品中，奶制品、調味品分布較少[6-9]。

我國GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》[10]規定花生油和玉米油中AFB1的限量值為20 μg/kg，其他植物油脂中AFB1的限量值為10 μg/kg。GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》[11]，包含同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法等[12-14]。上述方法均為實驗室檢測方法，樣品前處理過程繁瑣、檢測時間長、成本高，難以滿足基層監管過程中快速出檢測結果的需求[15]。當前，國內外市場上均有商品化的用于檢測食品中AF的膠體金免疫層析試紙條，該類檢測產品具有簡便、快速、廉價、對操作人員要求較低、現場結果可視化等優點，基本滿足基層監管的需求，可配備于農貿市場快檢室、快檢車等，對農產品及其制品中AF的監管控制和風險預警具有重要意義。到目前為止，國家食品安全監管部門先后共發布了11 項食品快速檢測方法[16-18]，其中9 項是膠體金免疫層析法。由此可見，膠體金免疫層析法是目前食品快速檢測領域的主要方法。為規范快速檢測產品在食品監管領域的應用，有必要對該類產品進行質量評價，保證它們的可靠性。

在國內，監管部門對快速檢測試劑的管理還處于初步階段。國家各相關監管部門先后發布了食品快速檢測試劑評價的標準或規范，以評價機制促使市場的優勝劣汰，提高產品質量，保證行業良性發展，使快速檢測在食品安全監管中真正發揮到有效作用。2017年，原國家食品藥品監督管理局發布食藥監科[2017]49號《關于規范食品快速檢測方法使用管理的意見》[19]，第五條規定各省（區、市）、計劃單列市、副省級省會城市食品藥品監管部門要按照食品藥品監管總局制定發布的《食品快速檢測方法評價技術規范》[20]和相應快速檢測方法等要求，通過盲樣測試、平行送實驗室檢驗等方式對正在使用和擬采購的快速檢測產品進行評價。評價結果顯示不符合國家相應要求的，要立即停止使用或者不得采購。同時，在通知中強調，在執行上述規范時發現的問題，及時向總局科技標準司反饋。《食品快速檢測方法評價技術規范》作為食品快速檢測評價工作的綱領性文件，對食品快速檢測方法的目的、適用范圍、評價指標、評價方法、評價步驟、評價結果及報告出具等列出了指導性要求。但是，在快速檢測試劑評價過程中的具體步驟未做說明，該規范有待逐步完善。例如，盲樣的制備方法、盲樣的均勻性和穩定性確定方法、樣品添加量設置、樣品數量設置、檢測結果與參比方法的一致性判斷方法等。

本研究以AFB1膠體金免疫層析試紙條的評價為切入點，系統性地研究膠體金免疫層析類食品快速檢測產品評價過程中具體的操作問題，主要包括樣品制備（均勻性、穩定性）、添加量設置、樣品量設置等。以期在國家規范內，做好產品評價過程中的每一個細節，發現存在的問題并探討在實際工作中的解決方法。本研究旨在為各級監管部門提供實踐依據，為快速檢測產品評價提供技術借鑒，有利于快速檢測市場的規范化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本次評價實驗使用的AFB1快速檢測試紙條/卡，采取網上咨詢，選擇3 家行業內認可度較高的公司的產品。為避免評價結果對生產廠家造成影響，對生產廠家進行了編序（A、B、C公司）。

AFB1免疫親和柱 美國Romer公司；AFB1標準品（純度≥98%） 國家糧食局科學研究院；甲醇（色譜純）西班牙Scharlab公司；乙醇（分析純） 西隴科學股份有限公司；NY針頭式過濾器 日本島津公司；磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Acquity UPLC H-class超高效液相色譜儀、Acquity UPLC BEH C18色譜柱 美國Waters公司；DHG-9420A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；M i l l i-Q超純水處理系統 美國密理博公司；QUINTIX213-1CN電子天平 德國賽多利斯公司；MMV-1000W振蕩器 上海愛朗儀器有限公司；RCT basic磁力攪拌器 德國艾卡公司。

1.3 方法

1.3.1 添加回收實驗

快速檢測產品評價實驗涉及到盲樣添加量實驗室測定賦值、盲樣均勻性和穩定性驗證，為確保儀器檢測方法的準確性，在開展盲樣制備之前先開展食用油中AFB1添加回收實驗。選取不含AFB1的花生油，添加AFB1標準品，然后用儀器分析，檢測其含量，并計算回收率。具體步驟如下：1）選取花生油樣本（AFB1含量低）；2）制備9 個樣品，平均分成3 組。每組樣品中添加不同水平的標準品，3 個添加量分別為10、16、20 μg/kg。3）以GB 5009.22—2016[11]的第三法：高效液相色譜-柱后衍生法（大流通池直接檢測），對上述樣品進行檢測，并計算樣品的添加回收率。

1.3.2 盲樣制備

根據《食品快速檢測方法評價技術規范》[20]，制備盲樣的基質應與實際食品樣品所含物質相似，本次評價實驗所用基質為花生油。該規范同時對測試水平提出了要求，測試水平一般應包括食品基質空白樣品，標準方法檢出水平（或者標準限量值）的0.5、1、2 倍水平或者其他可檢測區分的水平（不少于3 個），方法標稱檢測限0.5、1、2 倍水平或者其他可檢測區分的水平（不少于3 個）。按照規范[9]附表，將樣品按性質分為陽性和陰性兩大類，則含量在20 μg/kg（限量值）以上的樣品為陽性樣品，其他含量的樣品為陰性樣品。本次評價實驗設置4 個測試水平，分別為空白樣品、10 μg/kg（陰性樣品1）、16 μg/kg（陰性樣品2）、20 μg/kg（陽性樣品1）。

從市場上購買多種花生油，經儀器分析確證，AFB1都有檢出，最終選取AFB1含量低（0.65 μg/kg）的花生油作為空白樣品。向花生油中加入AFB1標準品，磁力攪拌器室溫條件攪拌12 h，制備成上述4 個水平的樣品，再用儀器檢測盲樣的均勻性和穩定性。

1.3.3 盲樣的均勻性和穩定性檢驗

為保證快速檢測評價實驗的準確性和公正性，根據規范“盲樣必須進行批內均勻性檢查，對于一定時間范圍內檢測的樣品，需要進行穩定性檢查，保證在評價期限內樣品穩定”。本實驗參考CNAS-GL003∶2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》[21]，將1.3.2節制備的各添加量的盲樣進行分裝（5 g/管），先用儀器進行檢測，每個樣品在重復條件下檢測3 次。采用單因素方差分析對數據進行統計分析，使用的軟件為IBM SPSS Statistics 22，通過F檢驗驗證樣品的均勻性[21]。

將其余樣品置-20 ℃貯存，分別間隔1、2、3 周取出，每次取出3 個樣品，每個樣品重復檢測3 次。參考CNAS-GL003∶2018[21]的方法，將不同貯存時間的檢測平均值與初始檢測平均值進行一致性比較，采用t檢驗法考察樣品在評價期內的穩定性。

1.3.4 快速檢測產品評價與結果統計

挑選有長期快速檢測工作經驗的人員進行評價實驗，每種快速檢測產品必需來源于同一個批次。在實驗開展前對快速檢測產品進行檢查，主要針對外包裝、試劑與輔助設備、產品說明書、產品基質的適用范圍、標示檢測限等。根據國家規范[22]中的指導性建議，每個測試添加量樣品的數量不少于50 例。因此，4 個添加量的盲樣共分裝出了250 例測試樣品，其中空白樣品、陰性樣品1、陰性樣品2均為50 例，陽性樣品1為100 例。按照AFB1的快速檢測方法[23]和各產品說明書的要求進行樣品前處理、快速檢測測試、結果判讀，并詳細記錄測試環境和快速檢測結果。實驗過程中，用每批樣品測試快速檢測產品的同時進行質控實驗，分別選取2 份空白樣品和2 份空白加標樣品（20 μg/kg）與測試樣品同時進行，確保評價結果的準確性。

按照國家規范[22]中“快速檢測方法性能指標計算表”可計算出快速檢測產品的各項性能指標。在評價測試的同時，對各快速檢測產品的檢測時間進行考察。按照3 個廠家自帶的產品說明書進行樣品前處理、快速檢測產品測試、結果判讀，記錄3 種快速檢測產品整個檢測過程所需時間。

2 結果與分析

2.1 添加回收實驗結果

花生油中普遍可檢出AFB1，難以收集到不含該毒素的樣品，因此本實驗采用AFB1含量低（0.65 μg/kg）的樣品作為空白樣品，以GB 5009.22—2016[11]的第三法進行檢測。為保證儀器檢測盲樣均勻性和穩定性結果的科學性，在開展評價實驗前，先驗證花生油中AFB1的添加回收率，見表1。此添加回收實驗的回收率范圍為89.52%～100.3%，符合GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》[24]中“方法回收率偏差范圍”。

表1 花生油中AFB1回收率Table 1 Recoveries of AFB1 spiked in peanut oil

2.2 樣品的均勻性檢驗結果

表2 3 種添加量樣品的均勻性檢測結果Table 2 Results for uniformity evaluation of samples spiked at three concentration levels

按照CNAS-GL003∶2018[21]對樣品的均勻性和穩定性進行驗證。首先對各添加量的盲樣均勻性進行檢測。然后，采用F檢驗對數據進行統計分析，SPSS軟件分析實驗結果的F值，均勻性檢測結果見表2、3。3 個添加量的F值均小于F臨界值[25]，P值均大于0.05，此結果表明在顯著水平α=0.05時，同一添加量的所有樣品間無顯著性差異，即制備的樣品均勻。

表3 測試樣品的均勻性分析Table 3 Uniformity analysis of tested samples

2.3 樣品的穩定性檢驗結果

盲樣制備完成后置于-20 ℃條件保存，從中取出用于穩定性檢測的樣品，每次取出3 個樣品，按GB 5009.22—2016[11]第三法進行檢測，每隔1 周檢測1 次，每個樣品重復檢測3 次，檢測結果見表4。

表4 測試樣品的穩定性檢測結果Table 4 Results for stability evaluation of tested samples

表5 測試樣品的穩定性分析Table 5 Stability analysis of tested samples

將不同貯存時間樣品的平均值與初始檢測平均值進行一致性比較，按照CNAS-GL003∶2018[21]中穩定性檢驗的要求，計算t值，見表5。查GB/T 15000.5—1994的附錄F可知t0.05(37)=2.026[25]，t值均大于2.026，表明各貯存時間的檢測結果與初始檢測結果之間存在顯著性差異。但是從各時間段檢測結果的平均值表現出變異程度較小。快速檢測產品本身只是對目標化合物進行初步篩查，對化合物的含量要求不需高度精確。因此，以本研究中的方法制備樣品，在短時間內完成快速檢測產品的評價，對評價結果的影響會較小。

2.4 產品的外觀與適用性

實驗前對3 個不同廠家的快速檢測產品的包裝、試劑和配件（滴管、96 孔架等）等進行檢查。它們的外包裝都完整（無破損）、試劑齊全且密封完好、附帶說明書、基質適用范圍合適、檢測限描述清楚，見表6。各廠家快速檢測產品的檢測限分別為5～50、10、20 μg/kg和8～20 μg/kg。不同檢測限所對應的樣品前處理操作略有不同，開展實驗前需要按照目標檢測限對應的方法進行操作。GB 2761—2017[10]和AFB1快速檢測方法[23]要求花生油中的檢測限均為20 μg/kg，各廠家的快速檢測產品檢測限符合要求。

表6 快速檢測產品外觀檢查結果Table 6 Characteristics of rapid test products

在實際應用中，快速檢測產品主要用于基層監管人員在市場上進行現場檢查，需要考察快速檢測產品在現場檢查中的適用性，例如，環境條件（溫度、濕度）、樣品前處理復雜程度、配套輔助設備（冰箱、離心機等）等。本研究從貯存條件、測試環境條件、提取液配制、樣品前處理步驟、配套輔助設備、檢測時間6 個方面對各廠家快速檢測產品的適用性進行評價，見表7。3 種快速檢測產品都可在常溫下貯存，便于攜帶和使用；測試環境可全部在室溫下進行，無特定條件；A、B、C廠家的提取溶液分別為70%甲醇（現配）、提取劑（自帶）、50%乙醇（現配）。3 種快速檢測產品對應的樣品前處理方法簡單、輔助儀器少，都需要移液槍。其中，A廠家的前處理中有稀釋步驟，B廠家的前處理中有稀釋和靜置分層過程，C廠家的前處理中有稀釋、混勻、溫育過程。由此可見，A廠家的樣品前處理最簡單，檢測用時較少，C廠家的樣品前處理最復雜，用時稍長。綜上所述，3 種快速檢測產品在現場應用中可較好地完成檢測任務，適用性良好。

表7 快速檢測產品的適用性評價Table 7 Applicability evaluation of rapid test products

2.5 產品測試結果

通過制備的樣品對各廠家的快速檢測產品進行測試，按照“快速檢測方法性能指標計算表”[20]對檢測結果進行統計分析，見表8。結果表明：添加量為1 倍限量值時，A、B、C廠家快速檢測產品的陽性檢測結果的概率分別為83%、100%、100%；添加量為0.8 倍限量值時，A、B、C廠家快速檢測產品的陽性檢測結果的概率分別為51%、96%、62%；添加量為0.5 倍限量值時，A、B、C廠家快速檢測產品的陽性檢測結果概率分別為12%、0%、0%。按照AFB1快速檢測方法（KJ 201708）[23]中的快速檢測產品性能指標的要求（假陽性率≤10%、假陰性率≤1%、靈敏度≥99%、特異性應≥90%），此3 種快速檢測產品性能均不達標。

表8 AFB1快速檢測產品評價統計結果Table 8 Statistical results for evaluation of rapid test products

膠體金免疫層析法原理是抗原-抗體特異性結合，具較高的靈敏度和特異性[26-27]。但是，它們不能進行精確定量，對抗原濃度在小范圍波動時難以準確識別，添加量在限量值水平附近時，很有可能檢出為陽性結果。因此，本實驗中0.8 倍限量值添加水平檢出陽性結果的概率在50%以上。

快速檢測方法性能指標計算表[20]僅將樣品區分為“陽性”和“陰性”兩類。GB 2761—2017[10]規定AFB1在花生油中的限量為20 μg/kg，含量低于20 μg/kg，則為陰性樣品，高于20 μg/kg，則為陽性樣品。所以，本研究中添加量20 μg/kg的樣品為陽性樣品，其他均為陰性樣品。AFB1快速檢測方法（KJ 201708）[23]規定快速檢測產品的性能指標須達到：假陰性率≤1%、假陽性率≤10%。如果膠體試紙條方法要保證樣品添加量大于20 μg/kg（陽性樣品）時檢出陽性結果概率大于99%，則無法做到樣品中其含量在0～20 μg/kg（陰性樣品）時檢出陽性結果概率小于10%。

本研究結果表明，樣品添加量的設置是決定評價結果的關鍵因素。如果不同機構使用不同濃度樣品評價同一快速檢測產品，必然得出不同的性能指標。如此，必然導致評價結果相互矛盾、評價系統混亂，評價機構將喪失權威性，從上到下的快速檢測評價工作將難以進行。例如，賈麗華等[28]僅設置3 個添加量（陰性、1 倍限量水平、2 倍限量水平）用于快速檢測產品評價，由于陰性樣品濃度約為0.5 倍限量值（濃度較低），而兩種陽性樣品的濃度較高。絕大部分快速檢測產品的假陰性率和假陽性率符合嘔吐毒素的快速檢測方法（KJ201702）[29]的要求。如果改變樣品濃度，則得出的性能指標必然發生變化。因此，針對不同快速檢測產品制定科學合理的評價方法是推進快速檢測評價工作的基礎。

對于膠體金免疫層析試紙條/卡的結果判定方法，有待進一步標準化。AFB1快速檢測方法（KJ 201708）[23]分別對比色判定方法和消線判定方法作了說明，見圖1。比色判定方法：無效，C線不顯色；陽性，T線明顯淺于C線；陰性，T線比C線深或T線與C線相當。消線判定方法：無效，C線不顯色；陽性，C線顯色，T線不顯色；陰性，C線顯色，T線顯色。除快速檢測方法對判定方法作了說明外，每個快速檢測產品都附帶了自身的判定方法說明，有的產品說明與快速檢測方法基本一致，有的有略微差別。

圖1 試紙條/檢測卡目視判定示意圖[23]Fig. 1 Schematic of visual judgment of test strip/detection card

C線和T線的顏色深淺與試紙條/卡生產過程中劃線抗原/抗體濃度有關，不同產品的劃線濃度不同，導致顏色深淺不同。T線顏色深淺不僅與劃線濃度有關，而且與待測液中目標化合物濃度有關。化合物濃度越高，T線顏色則越淺，反之，顏色則越深。總之，T線顏色的深淺呈現出連續變化的結果。在快速檢測結果判定中，無統一的量化標準，操作人員都只能按個人判斷判定結果，不同人員的判定結果必然存在差異。另外，人與人之間對顏色的敏感度差異也會進一步增加結果的判定差異。只有標準化的判定方法才能解決上述問題。將T線與C線的顏色深淺用儀器讀取，以數字化的形式顯示，不僅可避免操作人員之間的差異，而且便于規范結果判定方法。

3 結 論

本研究采用花生油基質加標的方法制備4 種不同添加量的AFB1樣品，對3 個不同廠家的膠體金免疫層析試紙條/卡進行評價測試。根據評價結果可知，制備的盲樣均勻性良好，快速檢測產品的包裝、說明書、試劑和配備器具等完好，檢測限符合標準要求，現場使用的適用性良好。各快速檢測產品的假陰性率和假陽性率不符合快速檢測方法的要求。另外，本研究發現樣品添加量設置是決定評價結果的關鍵因素，快速檢測產品評價亟需一套更加科學合理的評價方法。