犬瘟熱病毒融合蛋白的真核細胞表達及鑒定

白桂杰，張同存，校海霞

（1.天津科技大學生物工程學院 300457； 2.中國科學院天津工業生物技術研究所 300308）

犬瘟熱病毒（CDV）是引發犬瘟熱疾病的高致病性病原體，CDV 的感染性較強， 致病率較高。 主要的自然宿主包括犬科動物、熊貓科動物和靈長目動物等。 CDV 會通過呼吸系統、消化系統、泌尿系統和神經中樞系統進行傳播，可使動物出現卡他性炎癥或者神經性癥狀等[1]。 目前發現的CDV 基因型有17 種[2]，亞洲地區主要流行Asia 型，在我國流行的CDV 基因型主要為Asia 1型和Asia 2 型[3-4]。 近些年來，犬瘟熱疾病的發病趨勢逐年遞增，這給我國的毛皮動物養殖場和飼養寵物數量比較多的城市帶來了巨大經濟損失。

CDV 屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus），是無節段的負鏈單股RNA 病毒，該病毒的基因組呈線狀分布[5-7]，主要編碼六種結構蛋白[8-10]，其中融合蛋白（F）對于CDV 在侵入宿主細胞的過程中具有重要意義。 副黏病毒科的F蛋白不僅促進病毒囊膜與宿主細胞膜的融合， 還使細胞間發生膜融合形成合胞體[11]。 F 蛋白最初以F0形式存在，通過胞內酶裂解成由二硫鍵連接的F1和F2兩個單元，同時F1形成新的N 端，稱為融合肽（FP）。 在CDV-F 所介導的膜融合過程中，吸附蛋白（H）與細胞表面的受體結合使F 蛋白發生結構重排，F 蛋白的兩個七肽重復域（HR）會形成六螺旋束[12]，處于六螺旋束上的FP 靠近細胞膜促使病毒侵入細胞內。 有研究表明CDV-F 蛋白與副黏病毒科其他病毒F 蛋白序列同源性為70%～80%[13]，因此，F 蛋白具有高保守性這一特點可以作為研制F 蛋白的犬瘟熱特異性單克隆單體的前提條件。 本研究通過克隆CDV-F 蛋白胞外段基因、構建表達質粒、表達純化CDV-F 蛋白以及抗原性鑒定等實驗為CDV 抗原蛋白的免疫學性質的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒載體、細菌和細胞

大腸桿菌感受態Ecoli.DH-5α 菌株購自康維世紀生物有限公司；pFuse 載體和293T 細胞均由筆者所在實驗室留存。

1.2 實驗試劑

Pfu DNA 聚合酶及10 × Pfu buffer，dNTP 均購于天根生物有限公司；EcoR I、Xho I 等限制性內切酶、T4 連接酶、Zeocin 抗生素均購于Thermo Fisher 公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購于康維世紀生物有限公司；PEI 購于Alfa Aesar 公司；DMEM培養基購于英維捷基貿易有限公司、胰酶、胎牛血清均購于博奧瑞京科技發展有限公司；彩色預染蛋白Marker 購于柏奧易杰（北京） 科技有限公司；Anti-His 鼠單克隆抗體、 辣根過氧化物酶（HRP） 標記的山羊抗鼠單克隆抗體均購于天津三箭生物科技有限股份公司； 世紀元亨犬瘟熱單克隆抗體產于北京世紀元亨動物防疫技術有限公司； 吉林五星犬瘟熱單克隆抗體產于吉林五星生命源高科有限公司；HisTrapTM5mL 預裝柱、Superdex 200 10/300GL 均購于GE Healthcare 公司；TMB 顯色液購于北京索萊寶科技有限公司；CDV-sF 質粒以及特異性引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 真核表達質粒pFuse-CDV-sF-ecto 的構建

由于CDV-F 的氨基酸序列與MeV-F 蛋白的同源性高達71.4%，重組質粒pFuse-CDV-sF-ecto 是根據麻疹病毒融合蛋白的序列信息構建的，本次研究中設計的CDV-F 蛋白胞外段序列是第132 位氨基酸至第594 位氨基酸。以CDV-sF 克隆質粒為模板，在目的基因CDV-sF-ecto 的C 末端引入突變，加入His 標簽基因，利用引物P1 和P2 擴增目的基因，然后將克隆片段連接到pFuse 載體上得到重組質粒， 轉化至大腸桿菌感受態DH-5α，挑取單克隆至5mL LB 培養基，提取質粒后37℃條件下進行雙酶切（EcoR I 內切酶和Xho I 內切酶）鑒定，酶切結果正確的質粒送去測序，將序列正確的重組質粒命名為pFuse-CDV-sF-ecto。 利用Primer 5.0 軟件設計引物，所用引物如下：

上 游 引 物 P1：5’ -GAATTCGTGCTCCAAGGCCCAGATCCACTGG-3’（含EcoR I 酶 切 位 點）； 下 游 引 物P2：5’-GGCTAGCTCAATGGTGATGGTGGTGATGGCC-3’（含Xho I 酶 切 位點）。

1.4 重組質粒轉染293T 細胞

293T 細胞是由含有10%胎牛血清的DMEM 培養基進行常規培養， 在轉染的前一天進行傳代， 細胞匯合度達到70%～80%時， 將pFuse-CDV-sF-ecto 質粒轉染293T 細胞。 向2 個1.5mL EP 管中分別加入30μg 質粒和90μL PEI（1mg/mL），再分別補充適量的1 × PBS，靜置5min，將兩管混勻靜置20min，將混合液加入293T 細胞的培養皿中， 培養4～6h 后將原有培養基換成無血清的DMEM 培養基。 培養3～4d 后收集細胞上清。

1.5 Western Blot 檢測

驗證目的蛋白是否表達，將轉染的細胞上清進行離心濃縮，經SDS-PAGE 電泳跑膠之后， 將膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜（NC 膜）上。 用5%脫脂牛奶封閉；用TBST 洗膜；一抗為Anti-His 鼠單克隆抗體； 二抗為HRP-山羊抗鼠單克隆抗體； 最后用Western Blot 顯色試劑進行顯色分析。

1.6 目的蛋白的表達與純化

收集轉染后的細胞上清，4℃12000r/min 離心30～40min，除去細胞沉淀， 上清經0.22μm 濾膜抽濾后， 通過蠕動泵過夜過HisTrapTM5mL 預裝柱， 然后用AKTA 儀器進行蛋白純化， 利用20mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、300mmol/L 咪唑的洗脫緩沖液按照咪唑梯度洗脫方法收集目的蛋白。 將目的蛋白進行濃縮，500μL Loop 環上樣，用Superdex 200 10/300 GL 分子篩進一步純化，根據出峰位置收集蛋白，將蛋白樣品進行制樣，用12% SDSPAGE 膠跑膠鑒定。

1.7 ELISA 鑒定

將CDV-sF-ecto 蛋白按200ng/孔包被到96 孔板上，4℃包被過夜。 次日用3% BSA 封閉，PBST 進行洗板，一抗分別為世紀元亨犬瘟熱單克隆抗體、 吉林五星犬瘟熱單克隆抗體 （陰性對照）、Anti-His 鼠單克隆抗體， 以2 倍倍比梯度稀釋； 二抗為HRP-山羊抗鼠單克隆抗體； 洗板之后加入TMB 顯色液顯色，再加入50μL 2 M H2SO4終止反應； 用酶標儀讀取數據，GraphPad Prism 5 軟件處理實驗數據。

2 結果

2.1 重組質粒的克隆與酶切鑒定

以CDV-sF 質粒為模板，經PCR 擴增出來帶有His 標簽的CDV-sF-ecto 基因，1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠后， 在1487bp 處顯示有條帶（圖1），且條帶大小與目的片段大小相符。 將擴增片段用EcoR I 和Xho I 限制性內切酶進行雙酶酶切之后連接到pFuse 載體上， 構建好重組質粒命名為pFuse-CDV-sF-ecto。 用EcoR I 和Xho I 限制性內切酶進行酶切驗證（圖2），結果顯示酶切下的片段大小與目的片段大小相符。

圖1. 以CDV-sF 為模板的PCR 擴增

圖2. EcoR I 內切酶和Xho I 內切酶進行重組質粒的酶切驗證

2.2 Western Blot 檢測

細胞上清經SDS-PAGE 電泳跑膠， 將膠上蛋白轉移至NC膜上， 經Anti-His 鼠單克隆抗體和HRP-羊抗鼠單克隆抗體先后孵育后進行顯色分析。 結果表明，在變性條件下，44 KD 左右處有條帶出現， 即F1 蛋白； 在非變性條件下，60 KD（F0）、120 KD（Dimer）、180 KD 以 上（Oligomer）的 位 置 都 有 條 帶 出 現（圖3）。 表明CDV-sF-ecto 蛋白是以不同的聚集形式存在的。

圖3. CDV-sF-ecto 蛋白的Western Blot 分析

2.3 蛋白的表達純化

將收集的細胞上清經抽濾后，過鎳離子層析柱，蛋白洗脫下來的條件為20mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、70mmol/L 咪唑，收集濃縮，過分子篩層析純化，在多聚體位置（8.43 mL）出峰（圖4），得到0.2mg 目的蛋白。 將蛋白制樣進行SDS-PAGE 跑膠，結果如下（圖4），表明所表達的CDV-sF-ecto 蛋白主要以寡聚體形式存在。

圖4. CDV-sF-ecto 分子篩層析純化結果

圖5. CDV-sF-ecto 蛋白的ELISA 鑒定

2.4 ELISA 鑒定

將CDV-sF-ecto 蛋白包被到酶標板， 以世紀元亨犬瘟熱商業化單克隆抗體、 吉林五星犬瘟熱商業化單克隆抗體 （陰性對照）、Anti-His 鼠單克隆抗體分別為一抗進行鑒定。 結果顯示CDV-sF-ecto 蛋白可特異性結合世紀元亨犬瘟熱單克隆抗體和Anti-His 鼠單克隆抗體，EC50 的值分別為29.35μg/mL、0.07μg/mL（圖5）。

3 討論

近年來，隨著寵物犬和毛皮制造廠家的數量增多，犬瘟熱疾病感染趨勢呈現上升狀態。 目前還未出現有效的治療手段，接種疫苗是主要的預防措施， 但疫苗接種后會有母源抗原干擾等缺點。 所以，僅在預防接種階段采取措施還是不夠的，還要在控制病情發展等方面做出努力， 因此研制出針對保守的F 蛋白的單克隆抗體也是可以提高免疫控制的有效手段之一。 目前市場上的犬瘟熱單克隆抗體都是鼠源的，而且抗體特異性不確定，研制關于F 蛋白的犬源化的犬瘟熱特異性單克隆抗體， 不僅排除母體抗原的干擾，還可以增強抗體的特異性，從而提高治療效果。

犬瘟熱病毒F 蛋白在CDV 與宿主之間起到 “搭橋牽線”的作用，對于CDV 的感染是至關重要的，F 蛋白在真核細胞內表達量雖不高，但能夠使蛋白進行正確的糖基化修飾，有利于對F 蛋白結構以及抗原表位的研究，F 蛋白的結構解析也有利于抗體研究的進一步發展。

4 小結

本研究成功表達了CDV-F 蛋白的胞外段，ELISA 結果表明該蛋白與犬瘟熱病毒特異性單克隆抗體的結合活性較高。F 蛋白作為CDV 最重要的抗原蛋白之一，對于其功能和結構的解析都是至關重要的， 了解F 蛋白的免疫原性和作用機制可以為犬瘟熱疾病的變異機制和有效治療手段的研究奠定基礎[Barrett,1985 #14]。