曲克蘆丁及其代謝產物在大鼠體內的排泄動力學研究

余芳，金涌

作者單位：安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥230032

曲克蘆丁是黃酮類化合物蘆丁的半合成衍生物，可以抑制血小板凝集，防止血栓形成，具有抗氧化、抗炎、抗化學性肝損傷等一系列藥理作用；是臨床上用來治療慢性靜脈功能不全、毛細管出血、腦血栓等疾病的常用藥物[1-6]。近年來對曲克蘆丁的研究主要集中在藥理作用和作用機制等方面[7-10]，關于其代謝方面的研究知之甚少。曲克蘆丁在大鼠和人體內的藥代動力學研究表明曲克蘆丁口服吸收差，生物利用度低，臨床應用不良反應較多[11-12]。我們前期的研究結果表明曲克蘆丁在體內主要被腸道菌群代謝脫去蕓香糖成曲克蘆丁苷元[13]。因此弄清曲克蘆丁及其代謝產物在體內的排泄情況是研究曲克蘆丁的一個非常重要的補充。本研究起止時間為2018年7月至2019年3月，針對大鼠腹腔注射曲克蘆丁后其在尿液、膽汁和糞便樣品中的排泄情況，以及曲克蘆丁代謝產物在糞便中的生成量，探討了曲克蘆丁在體內的一般排泄規律。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與實驗動物 LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Neofuge23R臺式高速冷凍離心機（力康發展有限公司）；KQ-500DE型醫用數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A渦旋振蕩器（上海精科實業有限公司）；超純水機（美國Millipore公司）。

曲克蘆丁原料藥（阿拉丁試劑有限公司，生產批號T101630）；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，生產批號100080-201811，）、曲克蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，生產批號100416-201607）；甲醇（天津四友精細化學品公司，生產批號0113180403，色譜純）；其他試劑為分析純。

健康雄性SD大鼠5只，體質量范圍為（250±50）g，（安徽醫科大學實驗動物中心，動物實驗合格證號：皖醫實動準字第01號）。

1.2 色譜條件 色譜柱為Shim-pack ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；內標物為蘆丁；流速為1.0 mL/min；柱溫40℃；檢測波長350 nm；流動相為甲醇（A）和1.7%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～15 min，41%A；15～30 min，41%～65%A；30～40 min，65%～41%A）；進樣量20 μL。

1.3 實驗試劑和溶液配制

1.3.1 藥物溶液的配制 用0.9%的生理鹽水將曲克蘆丁制成5.25 mg/mL的溶液，臨用前配制。

1.3.2 標準溶液的配制 精密稱取蘆丁、曲克蘆丁、曲克蘆丁苷元對照品，用甲醇配制成質量濃度為1.0 mg/mL標準儲備液，4℃保存。

1.4 給藥與樣品采集

1.4.1 尿液和糞便 SD大鼠5只，雄性，分別置于5只代謝籠中，給藥前12 h禁食，不禁水，收集空白尿液、糞便。腹腔注射曲克蘆丁，劑量為52.5 mg/kg，分別收集0～2 h、2～4 h、4～8 h、8～12 h、12～24 h的尿液和糞便，測定尿液容積后置于-20℃冰箱保存。糞便烘干研碎稱重后置于-20℃冰箱保存。

1.4.2 膽汁 SD大鼠5只，雄性，給藥前12 h禁食，不禁水。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，仰臥固定于手術臺上，做膽管插管引流術，見有膽汁穩定流出后，收集空白膽汁。收集一段時間后腹腔注射曲克蘆丁，劑量為52.5 mg/kg，分別收集0～1 h、1～2 h、2～4 h、4～8 h、8～12 h的膽汁，測定膽汁容積后置于-20℃冰箱保存。實驗中腹腔注射2 mL生理鹽水以補充體液。

1.5 樣品預處理

1.5.1 尿液樣品預處理 分別精密吸取尿液樣品、內標蘆丁溶液100 μL于1.5 mL離心管中，加入100 μL甲醇，渦旋震蕩1 min使之充分混勻，10 000 r/min離心10 min。精密吸取200 μL上清液于另一干凈離心管中供高效液相色譜法（HPLC）檢測。

1.5.2 糞便樣品預處理 取大鼠糞便樣品，加2倍量生理鹽水，超聲10 min，制成勻漿，4 000 r/min離心10 min后取上清液。糞便精密吸取糞便勻漿上清液、內標蘆丁溶液100 μL于1.5 mL離心管中，加入100 μL甲醇，渦旋震蕩1 min使之充分混勻，10 000 r/min離心10 min。精密吸取200 μL上清液于另一干凈離心管中供HPLC檢測。

1.5.3 膽汁樣品預處理 分別精密吸取膽汁樣品、內標蘆丁溶液100 μL于1.5 mL離心管中，加入甲醇100 μL，渦旋震蕩1 min使之充分混勻，10 000 r/min離心10 min。精密吸取200 μL上清液于另一干凈離心管中供HPLC檢測。

2 實驗結果

2.1 方法學結果

2.1.1 專屬性考查 分別取空白尿液、空白糞便勻漿和空白膽汁，空白尿液、空白糞便勻漿和空白膽汁加曲克蘆丁和內標蘆丁對照品溶液，以及給藥后的樣品溶液，按“1.5”項下樣品預處理方法操作，進樣分析，得到相應的色譜圖。由圖可知，內標蘆丁和曲克蘆丁在大鼠空白尿液、空白糞便勻漿和空白膽汁中的保留時間分別為12 min和15 min左右，曲克蘆丁苷元的保留時間為35 min左右，分離度符合要求，雜質不影響測定。

2.1.2 線性關系 分別取空白尿液、空白糞便勻漿和空白膽汁，加入曲克蘆丁儲備液，制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、100.0、500.0、1 000.0 μg/mL的尿液樣品；0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL的糞便樣品；0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、100.0、500.0、1 500.0 μg/mL的膽汁樣品；取空白糞便勻漿，加入曲克蘆丁苷元儲備液，制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、80.0、400.0、800.0 μg/mL的糞便樣品，按“1.5”項下樣品預處理方法操作。橫坐標為曲克蘆丁和曲克蘆丁苷元的濃度，縱坐標為曲克蘆丁、曲克蘆丁苷元與內標蘆丁的峰面積比值，繪制標準曲線，得到標準曲線方程。曲克蘆丁在尿液、糞便和膽汁中的標準曲線方程分別為y＝0.0455x-0.0837（r＝0.999 8，線性范圍0.1～1 000.0 μg/mL）、y＝0.057 7x-0.051 5（r＝0.999 4，線性范圍0.1～80.0 μg/mL）、y＝0.043 3x+0.141 9（r＝0.999 9，線性范圍0.1～1 500.0 μg/mL）；曲克蘆丁苷元在糞便中的標準曲線方程為y＝0.053 8x-0.076 3（r＝0.999 1，線性范圍 0.1～800.0 μg/mL）。

2.1.3 回收率和精密度 分別取空白尿液、空白糞便勻漿、空白膽汁，加入曲克蘆丁對照品溶液，制成0.5、10.0、60.0 μg/mL的低、中、高三個濃度樣品，每個濃度制備5個樣品，按“1.5”項下樣品預處理方法進行處理后進樣，計算方法回收率。取空白糞便勻漿，加入曲克蘆丁苷元對照品溶液，制成0.5、10.0、60.0 μg/mL低、中、高三個濃度樣品，每個濃度制備5個樣品，按“1.5”項下樣品預處理方法進行處理后進樣，計算方法回收率。同時制備0.5、10.0、60.0 μg/mL曲克蘆丁和曲克蘆丁苷元對照品溶液，直接進樣。同等濃度尿液、糞便勻漿、膽汁中曲克蘆丁的峰面積和曲克蘆丁對照品峰面積的比值為提取回收率。同法配制低、中、濃度的尿液、糞便、膽汁樣品，按“1.5”項下處理后進樣，同日和連續5 d各測定5份樣品。計算日內和日間精密度。結果，曲克蘆丁在尿液中低中高濃度的方法回收率分別為（104.10±9.62）%，（98.05±6.29）%，（92.67±3.34）%（n＝5），提取回收率分別為（84.01±11.54）%，（85.47±7.82）%，（81.93±8.38）%（n＝5）；日內精密度分別為9.82%，7.51%，6.13%；日間精密度分別為5.46%，9.37%，8.25%。曲克蘆丁在糞便中低中高濃度的方法回收率分別為（90.0±6.67）%，（96.1±5.46）%，（93.19±7.22）%（n＝5），提取回收率分別為（78.05±11.11）%，（82.64±7.08）%，（72.95±8.66）%（n＝5）；日內精密度分別為8.66%，10.41%，7.75%；日間精密度分別為7.94%，10.27%，9.98%。曲克蘆丁在膽汁中低中高濃度的方法回收率分別為（94.15±8.51）%，（96.31±7.76）%，（96.59±3.80）%（n＝5）；提取回收率分別 為（74.10±10.64）% ，（83.26±8.80）%，（82.75±7.88）%；日內精密度分別為10.12%，8.53%，8.56%；日間精密度分別為8.62%，9.73%，10.64%。曲克蘆丁苷元在糞便中低中濃度的方法回收率分別為（90.20±10.51）% ，（95.32±9.68）% ，（100.08±7.66）%（n＝5）；%，提取回收率分別為（82.07±9.23）%，（77.62±11.28）%，（80.70±11.59）%（n＝5）；日內精密度分別為6.09%，4.45%，3.35%；日間精密度分別為5.63%，5.17%，7.06%。

2.1.4 定量限和檢測限 取曲克蘆丁對照品儲備液分別用尿液、糞便和膽汁稀釋，曲克蘆丁苷元對照品儲備液用糞便稀釋，按“2.1”項下方法測定，以S/N＝10計算，曲克蘆丁在尿液、糞便和膽汁中的定量限分別為0.17、0.11、0.14 μg/mL，曲克蘆丁苷元在糞便中的定量限為0.13 μg/mL；以S/N＝3計算，曲克蘆丁在尿液、糞便和膽汁中的檢測限分別為0.051、0.033、0.042 μg/mL，曲克蘆丁苷元在糞便中的檢測限為0.039 μg/mL。

2.2 排泄結果

2.2.1 尿液樣品中的排泄情況 大鼠腹腔注射曲克蘆丁52.5 mg/kg后，尿液中曲克蘆丁的累積排泄率為（16.17±10.28）%。見圖2。

2.2.2 糞便樣品中的排泄情況 結果表明曲克蘆丁大鼠腹腔注射曲克蘆丁52.5 mg/kg后，糞便中曲克蘆丁原型藥物的累積排泄率為（0.54±0.47）%，見圖2。曲克蘆丁代謝物曲克蘆丁苷元的累積生成量為（22.69±12.48）%，見圖3。

圖1 曲克蘆丁和曲克蘆丁苷元在大鼠尿液、糞便和膽汁中的高效液相色譜圖：A為空白尿液，B為空白尿液加對照品，C為給藥后尿液樣品，D為空白糞便，E為空白糞便加對照品，F為給藥后糞便樣品，G為空白膽汁，H為空白膽汁加對照品，I為給藥后膽汁樣品 圖2 大鼠腹腔注射給藥后曲克蘆丁在大鼠尿液、糞便和膽汁中的累積排泄率 圖3 曲克蘆丁苷元在大鼠糞便中的累積生成率

2.2.3 膽汁樣品中的排泄情況 大鼠腹腔注射曲克蘆丁52.5 mg/kg后，膽汁中曲克蘆丁的累積排泄率為（58.94±13.37）%。見圖2。

3 討論

新藥開發與研究中有很多重要的環節，其中藥動學研究是不可或缺的一環。影響藥物的生物利用度的一個重要因素就是藥物在體內的代謝情況[14]。近年來，曲克蘆丁在大鼠體內的排泄動力學及組織分布已有報道[15]，在人[11-12]和Beagle犬[16]體內的藥代動力學也有相關研究。但曲克蘆丁和其代謝產物在大鼠體內的排泄動力學尚未見相關研究。因此，本研究以大鼠為研究對象，腹腔注射曲克蘆丁后，對其在大鼠尿液、糞便和膽汁中的排泄與代謝進行了研究。

本研究中大鼠腹腔注射曲克蘆丁52.5 mg/kg后，曲克蘆丁在大鼠尿液（24 h）、糞便（24 h）和膽汁（12 h）中的累積排泄分數分別為（16.17±10.28）%、（0.54±0.47）% 和（58.94±13.37）% ，總 量 約 為76.00%；大鼠糞便中曲克蘆丁代謝產物曲克蘆丁苷元的累積生成量為（22.69±12.48）%。本研究結果表明，曲克蘆丁主要通過膽汁進行排泄；最后在糞便中生成代謝產物排出體外。這是因為相對分子質量大于300并且有極性基團的藥物主要通過膽汁排到腸道，最后隨糞便排出體外。腸道中有著種類豐富的腸道菌群[17]，糖苷類化合物可被腸道中的微生物水解生成苷元[18-19]。曲克蘆丁結構中存在著糖苷鍵，容易被腸道菌群水解釋放出苷元。同時糖苷鍵在酸性環境下容易水解，曲克蘆丁口服進入體內后在胃腸道內發生代謝轉化，這可能是曲克蘆丁血藥濃度低的一個重要因素。因此后續的工作將圍繞曲克蘆丁口服后的吸收機理和在體內的轉化進行展開，以期弄清曲克蘆丁在體內發揮藥效的作用機制。