程序性細胞死亡因子4基因對川崎病血清誘導血管內皮細胞凋亡的影響

孫真真，溫航衛，陶鳳姣，游亞蘭，彭新平

作者單位：1邵陽學院附屬第一醫院兒科，湖南 邵陽 422000；2湖南省人民醫院兒科，湖南 長沙410000

川崎病是一種全身非特異性的血管炎性疾病，主要發生于5歲以下的兒童[1]。目前，川崎病的發生機制尚不明確。研究顯示，川崎病的發生與冠狀動脈或中等肌性動脈內皮組織損傷有關，其中血管內皮細胞損傷是川崎病冠狀動脈損傷的重要原因[2]。程序性細胞死亡因子4（programmde cell death 4，PDCD4）是近年來發現的與細胞凋亡有關的凋亡調控因子，其可通過調控基因轉錄和表達影響細胞的生長凋亡[3]。PDCD4不僅在人類的皮膚、肺臟、結腸、卵巢等組織中表達，在心肌細胞、血管內皮細胞、腫瘤細胞等多種細胞中也有表達，并且對于不同的細胞凋亡調控作用不同[4-5]。研究顯示，PDCD4在高糖誘導的血管內皮細胞中表達升高，其可促進高糖誘導的血管內皮細胞凋亡[6]。2017年3月至2018年4月，本研究以明確PDCD4在川崎病血清誘導的血管內皮細胞凋亡中的作用為目的，為明確川崎病血管內皮損傷發生機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 一般材料 編號128人臍靜脈血管內皮細胞購自美國ScienCell；PDCD4抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；9661活化型Caspase-3（C-Caspase-3）抗體、9505活化型Caspase-9（C-Caspase-9）抗體購自美國Isoimperatorin；DP405RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2505311逆轉錄試劑盒購自德國Qiagen；SR1100 Real-time PCR試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司；Applied Biosystems PCR儀購自美國Thermo；R1200細胞總RNA提取試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；IPVH00010 PVDF膜購自美國Millipore；M2003 MTT試劑購自美國Sigma；Stratagene MX3005P Realtime PCR儀購自美國安捷倫；HBS-1096A酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司；IX73倒置顯微鏡購自日本Olympus。

1.2 血清分離 采集2017年5月邵陽學院附屬第一醫院典型川崎病病兒急性期和年齡相仿的健康兒童各5例的靜脈血4 mL，小兒川崎病診斷和納入標準參照文獻[7]，研究對象和正常對照的基本資料，年齡、性別和其它臨床資料差異無統計學意義。標本采集經過病人及其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。在4℃，4 000 g離心15 min以后，吸取血清，保存在-80℃。實驗前以0.22 μm微孔過濾器過濾。

1.3 Realtime PCR檢測川崎病血清對血管內皮細胞中PDCD4表達影響 血管內皮細胞分別用含有體積分數為10%川崎病血清和體積分數為10%的正常血清細胞培養液培養，記為川崎病血清組和正常血清組。細胞培養24 h以后，用Realtime PCR方法測定細胞中PDCD4表達水平。步驟為：用細胞總RNA提取試劑盒（TRIZOL）分別提取細胞中的總RNA，RNA用DEPC水溶解并保存在-80℃冰箱中。RNA濃度及純度檢測用紫外分光光度計（其OD260nm和OD280nm的比值在1.8～2.0之間）。用逆轉錄試劑盒分別合成各組cDNA。引物用Primer 5.0軟件設計，引物均由上海生工合成。PDCD4正向引物5′-CCAAAGAAAGGTGGTGCA-3′，反向引物5′-TGAGGTACTTCCAGTTCC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物5′-CAACGGATTTGGTCGTATT-3′，反向引物 5′-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3′。再依照Real-time PCR試劑盒進行定量PCR。以2-ΔΔCT法計算PDCD4表達水平，GAPDH作為內參，取內參和目的基因的Ct值的均值，ΔCt＝Ct目的-Ct內參，ΔΔCt＝[轉染組目的基因Ct值-轉染組內參基因Ct值]-[對照組目的基因Ct值-對照組內參基因Ct值]

1.4 蛋白質印跡法檢測血管內皮細胞中PDCD4、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（C?Caspase?3）、C?Caspase?9蛋白表達變化 取上述川崎病血清組和正常血清組細胞，添加D-hanks液將細胞洗滌3次，將孔內的液體分別吸盡，再添加含有苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，放在冰上反應10 min把裂解溶液收集轉移到離心管中，以功率為80 W的超聲儀超聲3次，每次2 s，間隔4 s超聲后，繼續置于冰上裂解10 min。以4℃，12 000 g離心20 min，把蛋白上清液轉移并保存。吸取蛋白樣品，依照BCA方法分別檢測蛋白濃度。將蛋白樣品添加至同體積的2×上樣緩沖液中混勻，以100℃煮沸5 min，每個孔中上樣量為40 μg。設置濃縮膠中電泳電壓為70 V，電泳30 min以后，設置分離膠中電壓為120 V，電泳90 min。裁剪合適大小的PVDF膜，置于4℃，100 V條件下轉膜，轉膜進行70 min。以5%牛血清白蛋白封閉液在37℃孵育90 min后，再與400倍稀釋的PDCD4一抗在室溫中孵育2 h，PVDF膜同1∶2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗在37℃孵育90 min以后，分別滴加顯色液，測量蛋白灰度值，GAPDH作為內參，分析目的蛋白表達水平。目的蛋白水平＝目的蛋白灰度值÷GADPH灰度值。

1.5 細胞轉染 血管內皮細胞匯合度為40%時添加病毒液，MOI＝30，病毒感染12 h后進行換液，用嘌呤霉素2 μg/mL抗性篩選轉染成功的細胞。血管內皮細胞中轉染PDCD4 siRNA和siRNA Control后用含有體積分數為10%川崎病血清的細胞培養液培養，分別記為si-PDCD4＋川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組。川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組細胞培養24 h以后，按照1.3和1.4中Realtime PCR和蛋白質印跡法檢測細胞中PDCD4表達水平。

1.6 MTT檢測下調PDCD4對川崎病血清條件下血管內皮細胞增殖影響 血管內皮細胞以密度為2×104/mL種植到96孔板內，按照正常血清組、川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組分組處理，在培養24 h以后將培養板取出。每個孔內添加20 μL的MTT溶液，放置于37℃孵育4 h，將上清溶液吸棄，繼續添加150 μL的DMSO，放置于搖床上震蕩10 min。測定波長570 nm的OD值，以不含細胞的孔調零，計算細胞存活率。細胞存活率＝（實驗組OD值÷正常血清組OD值）×100%。

1.7 流式細胞儀檢測下調PDCD4對川崎病血清條件下血管內皮細胞凋亡影響 按照正常血清組、川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組分組處理，繼續培養24 h以后，以PBS洗滌3次，制成單細胞懸浮液。1 000g離心10 min，分別在細胞中添加195 μL的Annexin V-FITC結合液，再添加10 μL的PI，放置于避光環境孵育15 min以后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。細胞凋亡率＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。

1.8 統計學方法 實驗數據用SPSS 21.0軟件進行分析。觀測資料均為計量資料，用表示，兩組比較為兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 川崎病血清處理后血管內皮細胞中PDCD4表達水平檢測結果 正常血清組和川崎病血清組細胞中 PDCD4 mRNA 水平分別為：（1.00±0.01）、（3.51±0.36），PDCD4蛋白蛋白水平分別為：（0.26±0.08）、（0.57±0.06）。川崎病血清組細胞中PDCD4 mRNA和蛋白表達高于正常血清組（P＜0.05）。

2.2 PDCD4 siRNA對川崎病血清處理的血管內皮細胞中PDCD4表達影響檢測結果 川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組和si-PDCD4＋川崎病血清組細胞中PDCD4 mRNA水平為：（1.00±0.01）、（0.91±0.09）、（0.41±0.06），PDCD4 蛋白水平為：（0.64±0.06）、（0.65±0.08）、（0.30±0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清組細胞中PDCD4 mRNA和蛋白表達水平低于川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組（P＜0.05）。

2.3 下調PDCD4對川崎病血清條件下血管內皮細胞增殖影響檢測結果 正常血清組、川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組細胞存活率為：（100.00±0.00）%、（72.01±7.32）%、（71.57±9.05）%、（89.52±6.80）%。川崎病血清組細胞存活率低于正常血清組（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清組細胞存活率高于川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組（P＜0.05）。

2.4 下調PDCD4對川崎病血清條件下血管內皮細胞凋亡影響檢測結果 正常血清組、川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組細胞凋亡率為：（6.32±0.58）%、（21.26±2.31）%、（22.58±1.79）%、（16.47±1.24）%。川崎病血清組細胞凋亡率高于正常血清組（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清組細胞凋亡率低于川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組（P＜0.05）。見圖1。

2.5 下調PDCD4對川崎病血清條件下血管內皮細胞中C?Caspase?3、C?Caspase?9蛋白表達影響檢測結果 川崎病血清組細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平高于正常血清組（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清組細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平低于川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組（P＜0.05）。見表1。

3 討論

川崎病可引起心肌炎、冠狀動脈擴張、心臟病等并發癥，研究顯示，川崎病血管內皮功能損傷是其發生的重要原因之一[8]。川崎病病人血清可以誘導血管內皮細胞凋亡并抑制細胞增殖[9]。本研究的結果顯示，川崎病病人血清處理后的血管內皮細胞凋亡率升高，細胞增殖能力降低，說明川崎病血清具有損傷血管內皮細胞的作用。

圖1 流式細胞術檢測下調PDCD4對川崎病血清處理的血管內皮細胞凋亡影響

表1 下調PDCD4后對川崎病血清處理的血管內皮細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達影響/

表1 下調PDCD4后對川崎病血清處理的血管內皮細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達影響/

注：PDCD4為程序性細胞死亡因子4；C-Caspase-3為活化型Caspase-3，C-Caspase-9為活化型Caspase-9；與正常血清組比較，aP＜0.05；與川崎病血清組比較，bP＜0.05；與si-NC＋川崎病血清組比較，cP＜0.05

images/BZ_104_238_461_1192_520.png0.27±0.04 0.56±0.08a 0.57±0.05 0.41±0.02bc 22.193 0.000正常血清組川崎病血清組si-NC＋川崎病血清組si-PDCD4＋川崎病血清組F值P值6 6 6 6 0.18±0.03 0.33±0.04a 0.35±0.06 0.25±0.03bc 10.443 0.004

PDCD4是在小鼠體內發現的凋亡相關基因，后續在人類和大鼠體內均發現有PDCD4表達。人類PDCD4基因定位于10q24染色體上，其cDNA全長為3.5 kb。PDCD4編碼的基因由469個氨基酸組成，其氨基端含有兩個α-螺旋結構域，這兩個α螺旋結構能夠同翻譯起始因子結合，從而抑制核糖體復合物的形成及蛋白質的合成[10-12]。PDCD4參與細胞的凋亡過程，其過表達可促進細胞凋亡[13]。研究顯示，PDCD4在血管內皮細胞損傷中表達上調，其表達水平的高低與血管內皮細胞凋亡呈正相關[14]。本研究的結果表明，川崎病病人血清處理后的血管內皮細胞中PDCD4表達上調，下調PDCD4能夠抑制川崎病血清誘導的血管內皮細胞凋亡，提示PDCD4可能參與川崎病血清誘導的血管內皮細胞損傷發生。

細胞凋亡是機體維持內環境穩定的重要途徑，其發生受到細胞內多種基因和蛋白的調控。研究顯示，Caspase蛋白家族參與細胞凋亡發生，其中Caspase-3等是細胞凋亡的效應物，Caspase-9等參與細胞凋亡激活和打靶等過程。Caspase蛋白家族成員以沒有活性的酶原形式存在，其只有被激活后可以誘導細胞凋亡發生[15-17]。Caspase蛋白家族成員參與血管內皮細胞凋亡過程，在動脈粥樣硬化、糖尿病心肌病等血管內皮細胞凋亡中均已經證實[18-19]。本研究的結果顯示，川崎病血清可以激活血管內皮細胞中Caspase-3和Caspase-9，說明川崎病血清可能通過活化細胞中Caspase-3和Caspase-9誘導血管內皮細胞凋亡。我們的實驗還表明下調PDCD4后，川崎病血清誘導的血管內皮細胞活化的Caspase-3和Caspase-9表達水平降低，提示下調PDCD4可能通過降低川崎病血清誘導的細胞Caspase-3和Caspase-9的活化減少血管內皮細胞凋亡，保護細胞免受損傷。

總而言之，川崎病血清可以通過上調PDCD4的表達誘導血管內皮細胞凋亡，下調PDCD4表達降低了川崎病血清誘導的血管內皮細胞凋亡。本研究結果為以后研究川崎病發病機制奠定了基礎，為研究PDCD4在川崎病發生中的作用提供了參考。本研究只在體外進行了細胞實驗，沒有在體內及原代血管內皮細胞中進行驗證，在后續實驗中會對這部分內容進行探討。