房水中IL-6和MCP-1濃度與視網膜靜脈阻塞合并黃斑水腫的相關性

梁雪嬌，杜紅艷

0引言

視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是視網膜血管疾病患者視力下降或喪失的第二大常見原因。其特征是視網膜靜脈栓塞導致視網膜毛細血管壓力增加，使毛細血管迂曲擴張，導致血管通透性增加、細胞外液滲入視網膜以及不同程度的水腫。黃斑水腫(macular edema，ME)是RVO的主要并發癥，表現為黃斑區視網膜神經上皮層的囊樣水腫，并可引起中心視力的下降，也是導致突然無痛性視力喪失的主要原因之一[1-2]。其發病機制仍未明確。近年來，隨著分子生物技術的發展，有學者研究發現，炎癥可能是導致RVO合并ME(RVO-ME)的原發因素，視網膜缺血、缺氧會誘導眼內液中炎癥細胞因子的表達增加，導致血管通透性增加并破壞血-視網膜屏障(blood retina barrier，BRB)，參與ME的形成[3-4]。目前我國關于房水中白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)與RVO相關性的研究相對不足，本研究主要是分析玻璃體腔內注射雷珠單抗(intravitreal ranibizumab injection，IVR)治療前后RVO患者前房水中IL-6與MCP-1濃度的變化，探討IL-6和MCP-1與RVO發病機理的相關性，進一步完善RVO的發病機制，為RVO-ME的治療提供更充分的理論依據。

1對象和方法

1.1對象隨機選取2017-11/2019-11在內蒙古自治區人民醫院確診為RVO并接受IVR治療的患者40例40眼作為治療組，其中男24例，女16例，年齡40～72(平均61.15±7.21)歲。年齡相關性白內障通常被認為是一種非炎癥性疾病，既往研究[5-9]選取白內障患者作為對照組，以說明炎癥與其他眼部疾病(如葡萄膜炎、年齡相關性黃斑變性、視網膜靜脈阻塞、青光眼等)的關系，故本研究選取同期需行白內障手術的單純年齡相關性白內障患者20例20眼作為對照組，其中男13例，女7例，年齡55～68(平均62.25±3.84)歲。兩組患者性別構成比、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P<0.05)。本研究經倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.1.1納入標準治療組：(1)散瞳后經三面鏡查眼底、熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)、光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)檢查確診為RVO-ME，且未經任何治療；(2)OCT顯示黃斑區中心凹厚度(central macular thickness，CMT)>250μm；FFA檢查顯示視網膜靜脈延遲充盈，管壁滲漏；(3)經眼底照相檢查顯示視網膜靜脈迂曲擴張，可見片狀或火焰狀出血，伴有黃斑區視網膜水腫；(4)病程<3mo。對照組：(1)除患有年齡相關性白內障外無其他眼部疾病；(2)無眼部藥物治療史及手術史；(3)無全身炎癥及免疫系統疾病、糖尿病等[10-11]。

1.1.2排除標準(1)近6mo內曾接受過眼科手術，如青光眼手術、局部視網膜激光光凝術、玻璃體切割術、玻璃體腔藥物注射等；(2)由RVO以外的視網膜疾病如年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、高度近視等引起的ME；(3)伴有其他眼部疾病，如牽拉性視網膜脫離、玻璃體積血、青光眼或高眼壓癥以及眼部炎性疾病等；(4)患有未得到控制的高血壓、心肌梗塞、心絞痛、腦梗塞、血糖控制不穩定的糖尿病、免疫系統疾病及意識障礙等；(5)處于妊娠期或哺乳期；(6)近3mo內有全身及局部抗炎藥物或激素使用史；(7)依從性差，不同意進行取樣及房水檢測[11-12]。

1.2方法

1.2.1術前準備術前所有患者均被告知本研究目的、手術過程、術中及術后可能出現的并發癥等情況，并進行全身及眼部相關檢查，排除惡病變及手術禁忌證。

1.2.2房水采集及治療方法

1.2.2.1治療組術前3d使用左氧氟沙星滴眼液點術眼，6次/d；術前剪睫毛、沖洗淚道、0.9%氯化鈉注射液15mL沖洗結膜囊，以預防感染。在眼科專用無菌手術間手術，患者取仰臥位，用鹽酸丙美卡因滴眼液點術眼行表面麻醉，碘伏消毒術眼3遍，鋪巾，貼膜，放置開瞼器，先用5%聚維酮碘沖洗結膜囊，再予以0.9%氯化鈉注射液15mL沖洗結膜囊，將帶有29G針頭的一次性無菌胰島素注射器針頭于角膜緣內1mm行前房穿刺，采集房水0.1mL。將房水樣品收集在無菌EP管中，并立即在-15℃冰箱中冷藏保存備用。房水采集后立即抽取雷珠單抗注射液0.05mL(0.5mg)，取顳上方距角膜緣3.5mm處，垂直于鞏膜面進針，將藥物緩慢推入玻璃體腔，注射完畢后，濕棉簽按壓30s，涂紅霉素眼膏，無菌敷料遮蓋患眼。術后給予左氧氟沙星滴眼液點眼(4次/d)、紅霉素眼膏(睡前1次)涂眼1wk局部抗炎治療，以預防感染。治療組患者采用1+PRN的治療方案，首次行IVR治療1mo后根據復查時眼底情況再決定是否治療，若復查時OCT顯示視網膜仍存在黃斑水腫伴CMT≥250μm或視力下降2行及以上，則需再行IVR治療，在IVR之前再次對所有患者的房水進行取樣。本研究納入治療組患者經復查后所有患者均再次行玻璃體腔藥物注射術。IVR及房水標本的收集均由同一外科醫生進行。

1.2.2.2對照組對照組患者均于白內障超聲乳化吸除術聯合Ⅰ期人工晶狀體植入術前收集房水樣本，樣本采集及保存方法同治療組。

1.2.3房水中IL-6濃度和MCP-1濃度檢測將房水樣本冷藏送至北京智德檢驗中心，Human IL-6 Flex Set試劑盒和Human MCP-1 Flex Set試劑盒、流式細胞儀均購自美國Becton Dickinson公司，采用流式CBA(Cytometric Beads Array)法檢測房水中IL-6 和MCP-1水平。將樣本放入離心機，13000r/min離心15min。配置Beads混合液和PE混合液后，取50μL Beads混合液于50μL的樣本中，將其置于震蕩儀中混合均勻，避光靜置1h。吸取50μL PE混合液，加入上述避光靜置完的混合液中，放入震蕩儀中震蕩混勻，再避光靜置2h。吸取1mL BD Wash Buffer加入避光完成的離心管中，洗滌，蓋好離心管管帽，上下顛倒2次，離心10min，棄去上層液體，再加入300μL BD Wash Buffer。蓋好離心管管帽，手指撥打離心管使Beads充分懸浮，上機檢測。

圖1治療組患者房水中IL-6和MCP-1濃度及CMT的相關性A：術前房水中IL-6濃度與CMT的相關性；B：術前房水中MCP-1濃度與CMT的相關性；C：術前房水中IL-6與MCP-1濃度的相關性。

1.2.4術后隨訪觀察治療組患者分別于首次IVR術前和術后1mo進行最佳矯正視力(best corrected visual acuity， BCVA)和CMT檢查。BCVA采用國際標準視力表檢測，將小數視力換算為最小分辨角對數視力(LogMAR)形式記錄，以便進行統計分析。CMT采用光學相干斷層成像(OCT-2000)測量。隨訪1a，觀察并記錄治療組患者并發癥發生情況。

2結果

2.1兩組患者房水中IL-6和MCP-1濃度比較術前，治療組和對照組患者房水中IL-6濃度分別為49.84±16.16、10.71±7.26pg/mL，MCP-1濃度分別為547.75±108.45、235.65±34.45pg/mL，差異均有統計學意義(t=12.927、16.603，均P<0.001)。首次IVR術后1mo，治療組患者房水中IL-6和MCP-1濃度分別為20.08±11.56、228.35±70.6pg/mL，均較術前顯著降低，差異均有統計學意義(t=23.750、21.574，均P<0.001)。

2.2治療組患者CMT和BCVA改善情況首次IVR術后1mo，治療組患者BCVA(0.55±0.25)較術前(0.88±0.33)顯著改善，CMT(298.63±67.73μm)較術前(519.85±132.74μm)明顯降低，差異均有統計學意義(t=10.212、16.676，均P<0.001)。

2.3治療組患者房水中IL-6和MCP-1濃度及CMT的相關性Pearson相關分析結果顯示，術前，治療組患者房水中IL-6和MCP-1濃度均與CMT呈正相關(r=0.646、0.912，均P<0.001，圖1)，表明隨著CMT的增厚，房水中IL-6和MCP-1的表達升高。而術前治療組患者房水中IL-6與MCP-1濃度亦呈正相關性(r=0.902，P<0.001)。

2.4治療組患者術后并發癥情況隨訪1a期間，治療組患者中，出現結膜下出血2例2眼，未予以處理，自行吸收，均未出現眼壓升高、視網膜脫離、眼內炎、葡萄膜炎等并發癥及全身不適。

3討論

RVO是一種常見的視覺障礙性疾病，廣泛累及視網膜周圍血管，其眼底主要表現為視網膜靜脈血管迂曲擴張，沿受累靜脈分布的線狀、片狀或彌漫性火焰狀視網膜出血，如若累及黃斑區，可見黃斑區視網膜水腫或棉絨斑，視盤水腫、邊界不清[13]。根據阻塞部位，RVO主要分為視網膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)和視網膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)[14]。目前世界范圍內RVO患病率為0.77%，其中BRVO占0.64%，CRVO占0.13%。截止到2015年，世界上約有2 806萬人患有這種血管性疾病，其中BRVO的發生率約是CRVO的6倍[15]。RVO主要好發于50歲以上中老年人，有研究表明，其患病率隨著年齡的增長而顯著增加，但沒有性別差異[16]。RVO的發病機制比較復雜，目前主要認為視網膜靜脈血栓形成、血管痙攣、靜脈血管本身的炎癥引起血管管腔狹窄或閉塞，導致視網膜血管壓力增加，使毛細血管迂曲擴張，靜脈回流受阻，同時視網膜不同程度的缺血、缺氧，產生多種細胞因子，導致BRB破壞、血管通透性增加、體液滲入視網膜形成不同程度水腫[15，17]。Ascaso等[18]發現，炎癥細胞因子在RVO病程中起重要作用。

IL-6是活化T細胞、單核巨噬細胞、纖維母細胞及某些腫瘤細胞分泌的一種分子蛋白，是具有多種功能的炎癥細胞因子。研究發現，在低氧條件下培養的內皮細胞中，IL-6 mRNA的表達隨著缺氧時間的增長明顯增加，表明長時間缺氧可刺激內皮細胞分泌IL-6[19]。IL-6可以作用于內皮細胞，使得肌絲排列進行重構，原有內皮細胞形態結構改變，管壁通透性增加，促進蛋白質等外漏；也可以通過間接誘導血管內皮生長因子(VEGF)表達而增加血管通透性和新生血管生成[3，20]。另外，IL-6還可以促進血栓形成，導致血管閉塞，誘導RVO的發生[21]。Feng等[22]研究結果顯示，RVO患者房水中IL-6的濃度顯著升高，且IL-6濃度隨著RVO-ME病情的加重而升高，是參與RVO-ME病程發展的重要炎性因子，該結論與Noma等[23]研究結果相符合。本研究中，術前治療組患者房水中IL-6濃度明顯高于對照組，且IL-6濃度與CMT呈正相關，這表明RVO患眼視網膜缺血、缺氧會誘導眼內液中IL-6表達增強，進一步加重黃斑水腫。

MCP-1是第一個被發現的屬于C-C家族的炎癥趨化因子。C-C家族是趨化因子家族的4個亞科之一，除C-C家族外，還包括CXC、CX3C、C家族[24]。MCP-1是一種小分子肝素結合蛋白，與受體(CCR2)結合后可發揮多種生物學活性功能。既往研究發現，MCP-1可調節內皮細胞的緊密性，視網膜缺血缺氧、動脈硬化和氧化應激時會增加MCP-1表達，MCP-1可促進內皮細胞緊密連接蛋白(如緊密連接蛋白-1、Occludin蛋白)磷酸化，造成BRB破壞，進而促進RVO-ME的發生[17，25]。MCP-1也可以趨化單核細胞和淋巴細胞向病損區域定向遷徙和聚集，從而激活巨噬細胞，巨噬細胞可吞噬受損細胞的殘片或分泌多種細胞因子來促進細胞凋亡，進一步加重炎癥反應。此外，MCP-1還可以刺激單核細胞產生氧自由基及釋放溶酶體酶，加重組織損傷[26-27]。Suzuki等[28]研究結果顯示，RVO患者房水中MCP-1濃度顯著升高，且MCP-1水平隨著RVO-ME病情的加重而升高，是參與RVO-ME病程發展的重要炎癥趨化因子。Zeng等[10]檢測了RVO患者房水中39種炎癥趨化因子，發現RVO患者房水中白細胞介素-8(IL-8)、趨化因子-9(CXCL9)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等表達顯著升高，但MCP-1表達正常。本研究中，我們通過對RVO患者房水中MCP-1濃度進行檢測，發現RVO患者房水中MCP-1的表達水平明顯增加，且MCP-1濃度與黃斑水腫的程度呈正相關，這表明MCP-1在RVO-ME的病程中起重要作用。

Andrey等[29]研究證實RVO患者房水中IL-6、MCP-1的表達顯著增強，且IL-6和MCP-1的表達之間存在關聯，IL-6可能通過誘導MCP-1表達而間接誘導血管滲漏發生，形成黃斑水腫。IL-6與MCP-1共同參與了RVO-ME的發病過程，RVO患者視網膜血管閉塞后繼發的炎癥反應可促使單核細胞分泌大量的IL-6、MCP-1等細胞因子[30]，IL-6既可以通過誘導肌動蛋白絲的重排導致相鄰細胞間的縫隙連接，從而增加內皮細胞的通透性，也可以增強VEGF和MCP-1等多種細胞因子的表達，導致新生血管的生成、血管通透性增加[31]。在MCP-1的作用下大量的炎性因子向炎癥或病損部位定向遷移及聚集，促進內皮細胞緊密連接蛋白磷酸化，造成BRB破壞，進而介導并參與RVO的病程。本研究中也發現治療組患者術前房水中IL-6濃度與MCP-1濃度具有相關性，隨著IL-6濃度的升高，MCP-1水平也升高(r=0.902，P<0.001)。總而言之，在視網膜缺血缺氧狀態下，局部微環境的改變誘導多種細胞產生IL-6和MCP-1，這兩種因子可相互作用導致其在細胞內的表達增加，共同參與RVO-ME的形成。研究認為，阻斷IL-6和MCP-1治療可以延緩或減慢RVO病程的進展[32]。雷珠單抗是一種可以結合VEGF-A所有亞型的單克隆人源化抗體片段，隸屬于抗VEGF藥物，其分子量小、親和力高，能很好地抑制新生血管的生成[17]。目前已有研究證實，雷珠單抗可以中和眼內VEGF，從而降低VEGF的有效濃度，降低視網膜血管的通透性，中斷正反饋途徑，進一步抑制炎癥，從而緩解黃斑水腫。另一方面，其可以通過減少TNF-α對視網膜色素上皮(RPE)層的刺激，進而抑制VEGF的生成，減輕黃斑水腫[33-34]。本研究中，治療組患者IVR治療后房水中MCP-1及IL-6濃度明顯降低，BCVA與CMT較治療前顯著改善，表明雷珠單抗可明顯降低MCP-1及IL-6濃度，減輕黃斑水腫程度，提高患者視力。

綜上所述，本研究表明以IL-6為主的炎性因子和以MCP-1為主的趨化因子均參與了RVO-ME的發病過程，且IL-6和MCP-1的濃度與RVO-ME的嚴重程度相關，提示炎性因子和趨化因子可以促進RVO病程的進展，為治療RVO-ME提供了新的治療靶點。然而，由于本研究樣本量較小且隨訪時間有限，且檢測樣本為房水而非玻璃體液，關于房水中炎癥細胞因子濃度與RVO的相關性、IL-6與MCP-1的相互作用機制、IVR治療RVO的長期療效及術后遠期并發癥等情況，還需要大樣本、多中心的隨機對照研究進一步驗證。